如何提高肌酸酶的稳定性和活性? ¹

肌酸酶是一种水解酶，参与肌酐代谢，催化肌酸水解生成尿素和肌氨酸。目前已在多种细菌中发现肌酸酶的存在，其中以Pseudomonasputida来源的肌酸酶研究最为广泛。

方法一：突变提高热稳定性

研究人员通过序列比对确定了Arthrobacter nicotianae 23710肌酸酶的热稳定性相关位点K195，并进行了饱和突变。突变体K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分别提高了260%、230%、60%和20%。此外，突变体K195V和K195C的酶活性分别提高了80.7%和88.2%。结构分析发现，突变体K195V、K195T和K195L相较于野生酶增加了7、12和13个氢键。研究结果表明，对Lys195的突变可以有效改变肌酸酶的热稳定性和催化效率，而分子内部氢键的增加可能是提高热稳定性的重要原因之一。

方法二：利用多聚赖氨酸提高pH稳定性

一项专利提供了一种提高肌酸酶pH稳定性的方法。该方法利用多聚赖氨酸对同源二聚体肌酸酶进行化学修饰。修饰后的肌酸酶在酸碱性条件下形成了“分子捆绑”作用，增强了亚基间的相互作用，有效防止了酶的解聚和失活。此外，修饰后的肌酸酶表面氨基增多，对外界酸碱环境的变化具有一定的缓冲作用。经修饰后，肌酸酶的pH稳定性由6-8提高至4-10，而kcat/Km仅降低了24%。该方法操作简单，适合工业化应用，并为其他多亚基酶的稳定性改造提供了一条可行的途径。

步骤1：分析肌酸酶表面酸性氨基酸

根据肌酸酶的氨基酸序列和结构分析，Pseudomonasputida来源的肌酸酶表面含有76个酸性氨基酸，可以参与多聚赖氨酸的修饰。

步骤2：多聚赖氨酸修饰肌酸酶

将肌酸酶表面羧基与多聚赖氨酸氨基按不同比例反应，经过修饰后的酶在不同pH值的缓冲溶液中具有较好的稳定性。修饰后的酶经过超滤除去未结合的小分子修饰剂，然后测定酶活力，以确定酶的pH稳定性。

以上方法为提高肌酸酶的稳定性和活性提供了有效途径，为肌酸酶在医疗诊断等领域的应用提供了方便。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201710376236.9 一种提高肌酸酶pH稳定性的方法

[2]阮洁,刘松,李江华,堵国成,陈坚.饱和突变提高肌酸酶热稳定性[J].食品与生物技术学报,2019,38(10):8-14.