克隆连接后无果～求赐教…？

EcoRI和BglII双酶切…大片段载体大概10kb，插入片段200bp左右，T4连接一直无果， 16度过夜后放4度半天，平板有些许克隆，但都不是重组产物，目测大部分都是载体片段……… 求大牛赐教该肿么破已经克隆了近俩月一直这个样 …… TT

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共9个回答

增加目的片段的量试一试，相应的降低质粒载体的量；换一种连接反应体系，比如TAKALA的有一种；

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会不会是酶切的问题呢？如果是用NEB的bglii，酶切buffer要用3.1，而不是smart。
啊… 确实我用的是smart 不过后来我单独用bglii切了一次跑胶也显示已经切开了呀并没有什么异常用smart对连接反应有很大影响么？

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感受态需要重新做，另外把载体的连接比换到1:7，再做一次

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检查一下内切酶是否过期，感受态是否失活

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检查一下内切酶是否过期，感受态是否失活
内切酶切后跑胶显示已经切开了 … 感受态同组的人也一直在用估计也是没啥问题

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会不会是酶切的问题呢？如果是用NEB的bglii，酶切buffer要用3.1，而不是smart。

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确定下两个酶会不会有一个用错了或者坏了

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感受态需要重新做，另外把载体的连接比换到1:7，再做一次
之前放的插入片段的比例比1:7还要大的多也没有成功… 难道是加太多了插入片段也不行么？

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克隆连接后无果～ 求赐教…？