碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)是一种在碱性环境中催化磷酸酯水解的酶。它的表达水平和活性变化与肝脏和骨骼的多种病理状态相关。联科生物提供的碱性磷酸酶活性检测试剂盒采用4-硝基苯磷酸盐(pNPP)作为底物，能够方便、快捷、灵敏地检测哺乳动物血清及其他生物样品中的碱性磷酸酶活性。
1. 试剂准备：将所有试剂(包括检测样品)取出并恢复至室温。标准品工作液：取15 μl p-nitrophenol溶液(10 mM)，用检测缓冲液稀释至0.3 ml，最终浓度为0.5 mM。
2. 检测方案参考如下。标准品的用量分别为2、4、8、16、24、32和40 μl，推荐进行两次重复。样品通常加入50 μl，如果样品中的碱性磷酸酶活性过高，可减少样品用量或适当稀释。为了消除有色样本本身颜色的影响，需要设立样品对照孔，即加入样本，以检测缓冲液代替显色底物的对照。
3. 加入所有样品后，在微孔板震荡器上震荡混匀数十秒。在37℃避光条件下孵育5-10分钟。如果待测样品中碱性磷酸酶活性较低，可适当延长孵育时间至30分钟。
4. 每孔加入100 μl终止液终止反应。
5. 在405 nm或400-415 nm范围内检测吸光度。如果不能立即测定，可在数小时内完成测定，所显现的黄色在数小时内稳定。
6. 结果计算：将标准品孔的OD值减去空白对照孔的OD值，校准后的标准品孔OD值与对应的p-nitrophenol浓度建立标准曲线。样品孔的OD值减去样品对照孔的OD值，校准后的样品OD值代入标准曲线，计算p-nitrophenol浓度。碱性磷酸酶活性(U/ml) = A/V/T。其中A为样品中产生的p-nitrophenol量(μmol)；V为样品体积(ml)；T为反应时间(min)。
7. 碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8的DEA缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解pNPP显色底物产生1 μmol p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个DEA酶活力单位。在pH9.6的甘氨酸缓冲液中，25℃条件下，每分钟水解pNPP显色底物产生1 μmol p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个Glycine酶活力单位。一个Glycine酶活力单位约相当于3个DEA酶活力单位。本试剂盒测定的是DEA酶活力单位。
1. 在使用本产品之前，请仔细阅读说明书。本产品仅用于科研，不可用于诊断。
2. 为了您的安全和健康，请穿戴实验防护服、手套、口罩等必要的防护装备。
3. 样品中不能含有磷酸酶抑制剂，如EDTA、草酸盐、氟化物和柠檬酸盐等。
4. 所有样品避免反复冻融，建议分装后冻存。
5. 血清样品通常需进行10倍稀释，其他样品可进行梯度稀释，使OD值落于标准曲线检测范围内。可使用原裂解液或PBS或本试剂盒提供的检测缓冲液进行稀释。
磷酸酶活性分析试剂盒产品介绍
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