本文将讲述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸如何用于酸性磷酸酯酶活性测定，旨在为其在临床应用提供参考。
简述：5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸对甲苯胺盐，英文名称：5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt，CAS：6578-06-9，分子式：C15H15BrClN2O4P，外观与性状：片状晶体。5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸对甲苯胺盐是显色底物，用于碱性磷酸酶活性的比色法检测。
应用：用于酸性磷酸酯酶活性测定。
在外加交变磁场中，磁性膜片受磁场激发产生磁矩，将磁能转换为机械能，并产生沿长度方向伸 缩振动，即磁致伸缩。当交变磁场频率与磁性膜片机械振动频率相等时，膜片产生共振，此时具有最大振幅，此时振动频率为磁性膜片共振频率。当磁性膜片传感器表面负载质量发生变化时，其共振频率也会随之改变。由于磁性膜片本身是磁性的，其伸缩振动产生磁通，产生的磁通可由检测线圈检测。磁弹性传感器中信号的激发与传送是通过磁场进行的，传感器与检测仪器之间没有任何物理连接，属于无线无源传感器，磁弹性传感器这一特点使得它在活体、在体分析中具有广泛的应用前景。
吴仕辉等人提出了一种新型磁弹性传感器用于酸性磷酸酯酶活性检测，该方法易操作，所用试剂简单，不需其它辅助试剂，且检测装置简易，便宜。该方法检测原理是以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸对甲苯胺盐(BCIP)为底物，经酸性磷酸酯酶水解后生成兰色二聚物沉淀，该二聚物沉淀能紧密附着在传感器表面，导致传感器共振频率发生变化，传感器共振频率变化幅度正比于酸性磷酸酯酶浓度。具体如下：
（1）传感器修饰
第一步，先用超声波清洗传感器，再用水和乙醇清洗，后用氮气吹干； 第二步，将10 μl Bayhydrol 110均匀涂在传感器表面，在空气中晾干后置于 150℃ 烘箱中烘2小时，使传感器表面形成一层牢固的保护膜，以保护磁片不被腐蚀的作用；第三步，将含0.02% EDC和NHS的BSA溶液涂在传感器表面，在空气中干燥；第四步，将干燥后的传感器置于冰箱保存。
（2）检测
将上述修饰后的传感器置于含1.5 mg/ml BCIP的柠檬酸缓冲溶液中（pH 4.8），在37℃下恒温10 min，使得传感器响应趋于稳定，并记录传感器此时共振频率?0。 然后将准备好的1.5~30 U/l系列酸性磷酸酯酶溶液加入至该反应池中开始反应。随 着反应时间进行，不断有沉淀附着在传感器表面，传感器共振频率发生改变，??=?－?0。实验中通过记录传感器在反应时间100 min内共振频率的变化幅度(??)来分析酸性磷酸酯酶的活性。所有实验数据均为三次平行测定后的平均值。
（3）酸性磷酸酯酶的测定
以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸对甲苯胺盐(BCIP)为底物的酸性磷酸酯酶催化水解反应的示意图如下图所示，酸性磷酸酯酶水解BCIP脱磷酸后得一中间产物，该中间产物在与溶液中的溶解氧的作用下迅速异构及二聚为一种兰色二聚物沉淀。这种兰色二聚物能紧密的附着在传感器表面，导致传感器的共振频率发生改变，且灵敏度较好。
（4）总结
实验中通过记录传感器共振频率变化幅度来检测酸性磷酸酯酶活性。同时还考察底物浓度对酶催化反应的影响，并通过BSA在传感器表面的固定对所生成的兰色二聚物在传感器表面附着能力进行了改善。该方法可用来检测1.5~15 U/l酸性磷酸酯酶，检测限达到1.5 U/l，检验灵敏度与分光光度法相当。由于该传感器制作简单，响应灵敏，并能实现无线检测，在临床应用中具有广泛的应用前景。
参考文献：
[1] 吴仕辉. 磁弹性无线生物传感器在生化分析中的应用研究[D]. 湖南:湖南大学,2006. DOI:10.7666/d.y892959.
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