Western Blot是一种将电泳与酶免疫测定结合起来的技术,用于分析样本组分的免疫学测定方法。在Western Blot中,抗体清除液(酸性)可以用于重复利用转移蛋白的膜,方便地检测其他蛋白。与重新跑一个SDS-PAGE胶相比,抗体清除液的使用不仅省时省力,还可以消除重新上样带来的误差,提高可比性。
抗体清除液(酸性)适用于NC膜和PVDF膜上的抗体清除。经过多个抗体的检测试验,通常可以重复利用膜3-5次。
1. 在完成Western化学发光检测后,用蒸馏水漂洗5分钟。
2. 弃掉蒸馏水,加入适量的抗体清除液(酸性),至少需将膜完全覆盖。在摇床上漂洗30-60分钟。
3. 弃掉抗体清除液,吸尽残余液体。加入TBS、TBST或PBS漂洗3-4次,每次在摇床上漂洗3-5分钟。
4. 进行后续的封闭等操作。
1. 如多次重复使用同一张膜5次以上,有可能会导致蛋白信号的减弱,建议膜重复使用不超过5次。
2. 使用ECL等化学发光试剂进行的Western Blot检测适用本试剂。使用非化学发光试剂进行的Western Blot检测,例如DAB,NBT/BCIP等,不适用于本试剂。
3. 抗体清除液有轻微腐蚀性,使用时请注意防护。
4. 使用辣根过氧化物酶(HRP)时,任何一次封闭都应使用5%脱脂牛奶;使用碱性磷酸酯酶时,任何一次封闭都应使用酪蛋白(casein)。
抗体清除液的应用不仅限于Western Blot,还可以用于研究细胞应激反应中的蛋白相互作用。例如,通过SILAC-蛋白组学分析和免疫共沉淀等方法,可以研究SIRT1在细胞应激反应中的作用及其机制。
SILAC-蛋白组学分析是一种利用稳定同位素标记的蛋白质进行定量的方法。通过将含有15N标记的精氨酸的培养基与普通培养基混合培养细胞,然后提取蛋白进行免疫沉淀纯化和质谱鉴定,可以筛选出与SIRT1相结合的蛋白。
免疫共沉淀是一种检测蛋白相互作用的方法。通过转染SIRT1质粒或其他相关质粒,提取蛋白后进行免疫共沉淀,可以检测SIRT1与其他蛋白的结合情况。
除了免疫共沉淀,还可以使用Western Blot和免疫荧光法来观察蛋白的表达和定位。