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求助帖：质粒提取摇菌失败求助？

新手第一次做质粒转化，挑菌、提取，做的是PNL-4-3这个质粒，转化使用热激法，质粒+感受态细胞stbl3结合冰浴30min,热激90s，在冰浴2min，加1ml的无抗LB培养基，摇1h，取10ml菌液铺固体培养基，虽然长菌挺密，但可挑出单菌落，然后10ml有抗培养基摇菌，摇了20管，过夜摇菌，浑浊了，然后用天根大抽提试剂盒，富集了将近200ml的菌体，严格按照说明书做，但最后提取出的质粒浓度不到50ng/ul，纯度OD260/280大于2，为什么呢？希望各位朋友解答一下，感谢

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共12个回答

幻墨轻尘，设备工程师 2021-02-17回答

那我是先用试管摇10ml，浑浊后，抽5ml，放锥形瓶摇100ml，可以吗
...
还有，试剂盒的洗涤buff要加无水乙醇的

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踏雪|寻梅，化工研发 2021-02-17回答

还有涂平板，如果是质粒转化，涂100-200微升菌夜就够了。你10毫升怎么涂的？
说错了，我用的是10ul涂板的，之前用的是100-200但每次都长满培养皿了

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十八嫂.十八哥，工艺专业主任 2021-02-17回答

挑斑可以直接加到锥形瓶里摇培，过夜能摇浑。你说的先用试管活化一下，试管太细，加的LB不宜太多，2-3-4毫升这个水平，白天摇几个小时微浑，然后1：500 1：1000加到锥形瓶里过夜都行，只要方法对了，都能做出来。 ...
那摇菌的时候用拿封口膜或保鲜膜把试管或锥形瓶的口封上吗

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只做风流人，实习生-操作员 2021-02-17回答

还有涂平板，如果是质粒转化，涂100-200微升菌夜就够了。你10毫升怎么涂的？

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树敌，化工研发 2021-02-17回答

同意某楼，1mL LB复苏培养后离心弃900微升，剩余的重悬菌体沉淀涂板，你的为什么是10mL

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把戏.花招.，给排水工程师 2021-02-17回答

菌液摇的不够浑，试管摇不开，用锥形瓶
那我是先用试管摇10ml，浑浊后，抽5ml，放锥形瓶摇100ml，可以吗

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注意了°，人事职员/行政职员 2021-02-17回答

挑克隆后先用5毫升摇菌，保种一毫升。剩下的四毫升提取质粒电泳鉴定。不要一来就大抽。小的证明没问题再大抽。

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贤惠，副矿长 2021-02-17回答

那我是先用试管摇10ml，浑浊后，抽5ml，放锥形瓶摇100ml，可以吗
...
挑斑可以直接加到锥形瓶里摇培，过夜能摇浑。你说的先用试管活化一下，试管太细，加的LB不宜太多，2-3-4毫升这个水平，白天摇几个小时微浑，然后1：500 1：1000加到锥形瓶里过夜都行，只要方法对了，都能做出来。

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花裙子白衬衣，销售 2021-02-17回答

挑克隆后先用5毫升摇菌，保种一毫升。剩下的四毫升提取质粒电泳鉴定。不要一来就大抽。小的证明没问题再大抽。
我们实验室没有做质粒电泳的机器，所以没法验证，只能大提

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白玖，销售 2021-02-17回答

那摇菌的时候用拿封口膜或保鲜膜把试管或锥形瓶的口封上吗...
不要用保鲜膜，可以用铝箔纸，大肠杆菌要透点气。只要加了抗生素，敞着盖子都能提出质粒

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Zj，工艺专业主任 2021-02-17回答

菌液摇的不够浑，试管摇不开，用锥形瓶

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奶气，研发工程师 2021-02-17回答

还有，试剂盒的洗涤buff要加无水乙醇的
...
嗯。加了

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