D-胱氨酸是一种重要的氨基酸，具有多种生物学功能和医药应用价值。其制备方法对于生物化学研究和药物开发具有重要意义。本文旨在探讨制备D-胱氨酸的方法，通过实验步骤的详细描述和质量检测结果的分析，为D-胱氨酸的制备提供可靠的参考和指导。
背景：D-胱氨酸为D-半胱氨酸的二聚体，通过还原手段可以有效获得重要的药物中间体D-半胱氨酸。D-半胱氨酸的制备工艺比较复杂，可采用不对称法直接合成，如喻明军等人以L-半胱氨酸、L-酒石酸、丙酮为底物通过不对称转化的方法制备D-半胱氨酸，而目前D-半胱氨酸生产大都采用化学拆分DL-半胱氨酸的方法，如张涛等人采用D- (-) -扁桃酸拆分DL-半胱氨酸生产D-半胱氨酸。
酶具有光学活性和催化特异性，因此可选择适当的酶作为外消旋体的拆分试剂。这种方法具有反应条件温和、选择性强、副反应少、收率高以及光学纯度高等优点。2009年，焦庆才等研究人员利用DL-半胱氨酸作为起始物质，将具有高活性的L-色氨酸酶基因工程大肠杆菌菌体细胞与含有DL-半胱氨酸或DL-半胱氨酸盐酸盐的转化液混合，随后在30～45℃下进行酶促反应。通过等电点结晶法或结合离子交换树脂的方法分离转化产物，成功制备出高纯度的D-半胱氨酸和L-色氨酸。实验室还采用高效表达的L-色氨酸酶的枯草芽胞杆菌发酵液作为酶源，利用酶法拆分DL-半胱氨酸以制备D-胱氨酸。
制备：
利用L-半胱氨酸脱巯基酶实现DL-半胱氨酸的拆分。将前期构建的含有恶臭假单胞菌TS1138菌株的L-半胱氨酸脱巯基酶基因的基因工程菌E.coli BL21 (DE3) -pET21a (+) -CD进行诱导表达，测定其酶活力为126.5 U/g。以该菌体为酶源，考查DL-半胱氨酸拆分条件。具体如下：
（1）酶活力测定
测定方法: L-半胱氨酸脱巯基酶酶活力采用2，4-二硝基苯肼法测定。0.75 mL 0.05% L-半胱氨酸与0.25 mL 6% K2HPO4混合后，加入0.5 mL酶源细胞 (菌体细胞湿重0.1 g) ，37 ℃反应2 h，取0.5 mL 反应液，加入等体积的2，4-二硝基苯肼溶液，37 ℃水浴20 min，然后加入0.4 mol/L NaOH 溶液5 mL，混匀，静置10 min后于500 nm下测定吸光度。
酶活力定义:在上述反应条件下每小时生成1 μmol 丙酮酸所需的酶量为一个酶活力单位 (U/g) 。
（2）L-半胱氨酸脱巯基酶的诱导表达及鉴定
从含有100 μg/mL Amp 的LB平板中挑取E.coli BL21 (DE3) -pET21a (+) -CD 单个菌落，接种到含有100 μg/mL Amp 的4 mL LB培养基的试管中，在200 r/min、37 ℃条件下培养12小时。随后，将1%的接种量转移到含有100 μg/mL Amp 的100 mL LB培养基中，在200 r/min、37 ℃条件下培养至OD600=0.5，然后加入终浓度为2 μg/mL 的IPTG 进行诱导，经过2小时后，以4,000 r/min 离心10分钟，收集菌体。收集后，用PBS (0.02 mol/L，pH7.2) 洗涤，然后用PBS (0.1mol/L，pH 8.0) 重悬，测定酶活力，并进行SDS-PAGE和BiCl3法酶染分析。
（3）柱前衍生HPLC检测
分别取不同浓度的标准品及反应液50 μL，加入100 μL 以丙酮配制的1%的FDAA和20 μL 1 mol/L NaHCO3溶液，40 ℃保温1 h后加入10 μL 2 mol/L HCl终止反应，取20 μL样品进样进行HPLC分析。
半胱氨酸检测色谱条件:C18色谱柱 (Phenomenex Luna 5μ，100A，250 mm×4.6 mm) ；柱温:25℃，进样量:20 μL；检测波长:340 nm.流动相为水 (含0.1%TFA) ∶乙腈 (含0.1%TFA) =1∶1。
胱氨酸的检测方法和色谱条件与半胱氨酸检测方法一致。
（4）拆分条件的考查
以重组大肠杆菌菌体为酶源，考查不同的转化条件对D-半胱氨酸纯度的影响。其中，考察pH与D-半胱氨酸纯度的关系时，pH范围为6.5～9.5，菌体浓度5 g/L；底物DL-半胱氨酸用量为5 g/L；转化温度为40 ℃；转化时间为0.5 h；考察反应温度与D-半胱氨酸纯度的关系时，转化温度范围为20～60 ℃，菌体浓度5 g/L，底物DL-半胱氨酸用量为5 g/L，转化pH值为9.0;转化时间为0.5 h；考察底物DL-半胱氨酸与D-半胱氨酸纯度的关系时，底物DL-半胱氨酸浓度范围为1～12 g/L，菌体浓度5 g/L，转化温度为45 ℃，转化pH值为9.0；转化时间为0.5 h；考察菌体浓度与D-半胱氨酸纯度的关系时，菌体浓度范围为1～50 g/L，底物DL-半胱氨酸用量为6 g/L；转化温度为45 ℃；转化pH值为9.0;转化时间为0.5 h；考察反应时间与D-半胱氨酸纯度的关系时，转化时间范围为20～300 min，菌体浓度10 g/L，底物DL-半胱氨酸用量为6 g/L；转化温度为45 ℃，转化pH值为9.0。
（5）DL-半胱氨酸的拆分及D-胱氨酸检测
根据确定的最佳拆分反应条件，在1 L甘氨酸-氢氧化钠 (0.2 mol/L，pH 9.0) 缓冲液中完全溶解6 g DL-半胱氨酸。随后，使用6 mol/L的NaOH溶液微调pH至9.0，加入10 g酶源细胞，在45 ℃下轻微振荡反应1小时。随后，以4,000 r/min低温离心10分钟，去除菌体，收集上清液。将上清液通入空气12小时，使D-半胱氨酸氧化为D-胱氨酸，随后用3 NHCl调节pH至5.0，使D-胱氨酸结晶析出。收集沉淀，用乙醇洗涤干燥，得到D-胱氨酸。随后对产品进行质量检测，使用柱前衍生HPLC法测定产物纯度，进行红外光谱和比旋度测定，依据中国药典 (2010版) 对L-胱氨酸的检测标准进行D-胱氨酸的检测。
（6）D-胱氨酸的制备
确定其最佳pH为9.0，最佳反应温度为45℃，最佳底物浓度6 g/L，最佳菌体浓度为10 g/L，最佳反应时间为1 h.在该条件下拆分DL-半胱氨酸,催化反应后离心收集上清液，通入空气搅拌，使D-半胱氨酸氧化为D-胱氨酸，经过过滤、洗涤、精制、烘干，获得1.86 g的D-胱氨酸，D-半胱氨酸的回收率为64.6%。经柱前衍生HPLC分析，结果表明，产品纯度约为98.7%。
参考：
[1]张玺. L-半胱氨酸脱巯基酶拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸的研究[D]. 天津:南开大学,2011. DOI:10.7666/d.y2002227.
[2]杜军,张奇,段静静,等. 利用L-半胱氨酸脱巯基酶拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸[J]. 南开大学学报（自然科学版）,2011,44(5):82-87. DOI:10.3969/j.issn.0465-7942.2011.05.014.
1
