顺式反式异构化是肽键的一种常见现象，对蛋白质的结构和功能有着深远的影响。N-乙酰-L-脯氨酸作为一种简单的肽模型化合物，其顺式反式平衡值的测定，为研究蛋白质肽键异构化规律提供了重要的实验数据。
背景：什么是顺式和反式异构体？
顺反异构是立体异构的一种，由于双键相连的两个碳原子不能绕σ键作相对的自由旋转引起的，一般指烯烃的双键，也有C=N双键，N=N双键及环状等化合物的顺反异构。
（1）顺式异构体：两个相同原子或基团在双键同一侧的为顺式异构体，也用 cis- 来表示。
（2）反式异构体：两个相同原子或基团分别在双键两侧的为反式异构体，也用 trans- 来表示。
下图为N-乙酰基-L-脯氨酸的的顺式和反式异构体：
Ktrans 值解释
在蛋白质中，相邻氨基酸残基的酰胺键中的电子离域导致氮和羰基碳之间键的旋转受限。因此，肽基团的四个原子 O–C–N–X（X=H，脯氨酸除外）以及相邻的 α 碳是共面的或几乎共面的（2）。超过 99% 的肽键采用反式构型，这使 α 碳及其庞大的侧链基团保持在 C–N 键的相对侧。然而，在脯氨酸酰胺键中，X 是吡咯烷环的 δ 碳，这产生了额外的空间约束。这导致顺式和反式的能量相当接近。因此，在自然系统中观察到这两种连接，相互转化表示为：
N-乙酰-L-脯氨酸的顺式反式平衡值
N-乙酰-L-脯氨酸的顺反异构体平衡是一个简单但具有重要意义的系统，能够清晰地展示溶剂极性和溶液 pH 对其平衡的影响。除了在生物物理实验中的预期应用外，这种研究还适用于仪器分析和有机光谱实验室。
Kathryn R. Williams 等人通过氢核磁共振（H-NMR）研究了溶剂的 pH 值和极性对 N-乙酰-L-脯氨酸顺反异构体平衡常数 Ktrans 的影响。Ktrans 值作为一种测定顺式与反式异构体之间平衡的指标，通过对 H-NMR 谱图中峰下面积的积分及计算得出。该值可用于确定样品中顺式异构体的相对含量。
实验描述
N-乙酰-L-脯氨酸（N-AcPro）可作为脯氨酸肽键的简单模型。已在各种溶剂系统中报告了大量关于这种平衡的 NMR 研究。
研究通过确定 d6-丙酮（相对极性）和 45:55 d6-苯-CDCl3 混合物（非极性）中的 Ktrans 来观察极性效应。四种溶剂系统（45:55 d6-苯-CDCl3、d6-丙酮、pH 为 7 的 D2O）展示了溶剂极性和水相 pH 值的影响。由于实际应用中感兴趣的肽键几乎全部发生在水环境中，因此 N-AcPro 的 Ktrans 值也在两个 pH 值（低于 2 和高于 7）下在 D2O 中测量。先前的研究表明顺式比反式更酸性（顺式异构体的 pKa 约低 0.6 个单位）。此外，当 N-AcPro 完全去质子化时，顺式-反式平衡向左移动，顺式略占优势（Ktrans 约 0.8）。这些观察结果最初似乎与质子化反式中的分子内 H 键相称（10）。然而，Lauterwein 等人。 有研究测量了 pH 过渡间隔内 N-AcPro 的 17O 化学位移，并观察到顺式和反式的平行行为。将 pKa、化学位移和 Ktrans 效应归因于酰胺偶极子相对于羧基的方向。实验的 pH 值选择是为了清楚地展示 pH 对 Ktrans 的影响。下图显示了苯-氯仿混合物中 N-乙酰-L-脯氨酸的 Hα 和 Hδ 区域。在其他溶剂系统中观察到了类似的分辨率。学生评估四组积分（α-反式与 α-顺式、δ-反式与 δ-顺式、α-反式与 δ-顺式和 δ-反式与 α-顺式）的 Ktrans，并计算 95% 置信区间。
如表中的典型数据所示，清楚地显示了极性和 pH 值的影响：
为什么 n-乙酰-l-脯氨酸在低 ph 下有利于反式？
除高 pH 值的水溶液外，反式占主导地位。在非水系统中，随着溶剂极性的降低，平衡常数会增加。人们普遍认为，在非极性溶剂中，反式异构体有利于形成分子内氢键，从而“保护”羧基氢免受非极性环境的影响。
N-乙酰-L-脯氨酸在低 pH 条件下更倾向于呈现反式异构体的原因与 pH 对分子内部氢键和静电相互作用的影响有关。在低 pH 环境下，溶液中存在大量的氢离子（H+），这些氢离子与脯氨酸分子的羧基氢原子结合，从而减少了羧基的负电荷。这一变化消除了羧基间由于静电排斥而产生的相互作用。具体来说，反式异构体较为稳定，因为它在分子内部形成了更强的氢键，这些氢键发生在羧基与酰胺基的氧原子之间，从而减小了分子内部的空间排斥。这种氢键作用使得反式异构体在非极性溶剂中更为稳定，因为氢键使分子呈现出较低的极性状态，减少了分子间的静电相互作用。在低 pH 条件下，羧基上的氢原子未被去除，避免了由于静电排斥引起的立体障碍，从而使反式异构体的稳定性得到增强。相反，在高 pH 环境中，基本条件会去除羧基上的氢原子，使得分子中出现静电排斥，导致反式异构体不稳定并转向顺式异构体。因此，在低 pH 环境中，N-乙酰-L-脯氨酸更倾向于形成反式异构体。
参考：
[1]Williams K R, Adhyaru B, German I, et al. The Cis-Trans Equilibrium of N-Acetyl-L-Proline. An Experiment for the Biophysical Chemistry Laboratory[J]. Journal of chemical education, 2002, 79(3): 372.
[2]Lauterwein J, Gerothanassis I P, Hunston R N. A study of the cis/trans isomerism of N-acetyl-L-proline in aqueous solution by 17 O nmr spectroscopy[J]. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1984 (6): 367-369.
[3]https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0584853994E0075L
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