如何提高L-酪氨酸的生产效率? ¹

在医药和化学领域，L-酪氨酸具有广泛的应用。作为许多重要次级代谢产物的前体，以及帕金森氏病药物L-DOPA的重要前体，L-酪氨酸的生产仍然面临着挑战，因为其生物合成途径复杂且调控困难。

研究发现：

之前的研究表明，失活tyrR基因和解除aroG和tyrA基因的反馈抑制是过量合成L-酪氨酸的常见方法。然而，本研究通过实验提出了新的观点，认为失活tyrR基因并不是过量合成L-酪氨酸的必要条件。相反，合适的补料策略和失活内运蛋白tyrP对于提高L-酪氨酸的产量更为有效。

图1：大肠杆菌中L-酪氨酸生物合成途径

研究内容：

（1）aroGfbr和tyrAfbr单基因过表达对酪氨酸产量的影响

本研究利用大肠杆菌BL21(DE3)和tyrR敲除菌株，分别过表达aroGfbr和tyrAfbr基因。结果发现，在L-酪氨酸的生产中，aroGfbr的过表达比tyrAfbr更为有效。然而，最佳菌株BTY1.1产生了大量的副产物L-苯丙氨酸，代谢通量分布不理想。

（2）aroGfbr与tyrAfbr、aroL或aroK两基因过表达对酪氨酸产量的影响

在野生型和tyrR敲除菌株中，分别过表达aroGfbr与tyrAfbr、aroL、aroK、aroBopt或aroE基因。研究发现，在本实验系统中，aroGfbr与aroL的组合效果最佳。推测aroL编码的酶催化莽草酸转化为莽草酸磷酸酯，是限速步骤。然而，任何过表达组合都未达到单独过表达aroGfbr的L-酪氨酸产量。

（3）aroGfbr、aroL与tyrAfbr或tyrC三基因过表达对酪氨酸产量的影响

在野生型和tyrR敲除菌株中，利用双载体系统和单载体系统检测aroGfbr、aroL和tyrAfbr或tyrC的过表达效果。结果发现，单载体表达系统效果较好，而tyrC对于L-酪氨酸的产生比tyrAfbr更为有效（注：tyrC是从运动假单胞菌中获得的基因，具有与tyrA相似的功能，但对L-酪氨酸不敏感）。

（4）删除酪氨酸特异性和芳香族氨基酸转运蛋白对酪氨酸产量的影响

在野生型和tyrR敲除菌株中，依次敲除tyrP（L-酪氨酸特异性转运蛋白）、aroP（芳香族氨基酸转运蛋白）、tyrP和aroP，并导入单载体三基因表达系统。研究发现，高产L-酪氨酸的三种菌株（BTY5.13，BTY2.13和BTY7.13）均失活了tyrP，表明失活tyrP有助于改善L-酪氨酸的生产。

（5）补料分批发酵

在5L生物反应器中，采用Exponential-to-DO-stat和DO-stat补料策略测定四种改造菌的效果。最佳菌株BTY2.13采用Exponential-to-DO-stat补料策略发酵，L-酪氨酸产量可达43.14g/L，转化率达0.107g/g。

表1：不同补料策略下改造菌的生长及产物合成情况

研究结论：

本研究发现，失活tyrR基因并非提高L-酪氨酸产量的必要条件。相反，选择合适的载体系统和补料策略，以及失活内运蛋白tyrP，对于过量合成L-酪氨酸更为有效。

在DO-stat补料模式下，未失活tyrR的菌株产生了较多的乙酸，表明其代谢发生了溢流，其机理仍需进一步研究和探索。