如何制备酸性磷酸酶的常用试剂? ¹

酸性磷酸酶的常用试剂包括二磷酸酚酞或其四钠盐、百里酚酞单磷酸二钠和萘胺单磷酸二钠。这些试剂是经典磷酸盐衍生物，常以钠盐的形式使用。其中，二磷酸酚酞或其四钠盐更为有效，易于观察，成本低且毒性较低。

制备步骤

首先，在50g的烧杯中称重8.0g的酚酞，然后转移到三管状气球中，这些气球浸入碎冰浴和粗盐中。接下来，加入12.5ml二氯甲烷和6.3ml三氯氧化磷，进行强烈搅拌，以获得均匀悬浮液。将含有6.3ml三乙胺的恒压加料漏斗与三管烧瓶相连，保持反应温度不超过4°C，在最高4°C的搅拌下保持6小时。添加少量的10％NaOH溶液来评估反应进程，如果观察到粉红色，则可以将反应保持在室温下。如果观察到无色的阴性结果，则应重复该测试。

然后，蒸发除去二氯甲烷，并在约4°C下不断搅拌下加入100ml冷蒸馏水。释放所有HCl蒸气后，观察到形成类似琥珀色的淡黄色沉淀物质。在搅拌下，添加40％NaOH溶液，直到所有沉淀物重新溶解为止。使用pH1.00的无机酸酸化邻苯二甲酸二磷酸酯的水溶液，使苯甲酸邻苯二甲酸二磷酸酯沉淀。然后，从上清液中分离出该物质，并将酸性双磷酸苯酞的全部物质溶于最少量的新鲜蒸馏的VetecPA级甲醇中。加入几滴VetecPA级甲酰胺以增加溶解度，并在搅拌下加入1.0mol.L^-1乙醇钠溶液，直到所有沉淀完成。通过过滤分离苯基酞菁双磷酸四钠的沉淀，然后用无水乙醚反复洗涤邻苯二甲酸酯双磷酸四钠，重复该步骤直到固体几乎干燥。最后，将邻苯二甲酸二苯酯双磷酸四钠溶解在最少量的甲醇/甲酰胺（5：1）中，然后缓慢加入乙醇，使纯化的二磷酸酚酞重新沉淀。过滤分离后，将二磷酸酚酞四钠保持在真空干燥器中。

参考文献

[1] WO2015035487 METHOD AND KIT FOR SYNTHESIZING PHENOLPHTHALEIN DIPHOSPHATE TETRASODIUM