蛋白酶K是一种与枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶，源自Tritirachium album Limber。它以其降解角蛋白的能力而得名，并且在变性尿素或十二烷基磺酸钠（SDS）溶液中仍能保持高酶活性，因此被广泛应用于各种生物材料中DNA或RNA的提取。
蛋白酶K由一条含有277个氨基酸残基的肽链组成，相对分子质量为28,930。它的活性位点由D39、H69和S224组成，底物识别位点主要由G100-Y104和S132-G136两个片段组成。蛋白酶K的氨基酸序列与枯草杆菌蛋白酶高度相似，因此被归类为枯草杆菌蛋白酶。蛋白酶K含有两个二硫键（C34-C124、C179-C248）、两个色氨酸残基（W8、W212）和一个游离半胱氨酸（C73）。X射线晶体学研究显示蛋白酶K具有明确的球形折叠结构。它属于α/β类蛋白质，包含6个α-螺旋、15个β-折叠和一个3/10螺旋。
蛋白酶K在295 nm处被激发，其荧光由两个色氨酸残基W8和W212决定。然而，这两种色氨酸的光反应性不同，W212的活性要高得多。在pH 3-9范围内，色氨酸的荧光量子产率是恒定的。激发态色氨酸的热灭活需要54 kJ/mol的活化能，这个值远高于其他微生物蛋白酶，因此可以解释蛋白酶K具有更高的热稳定性。
蛋白酶K具有高切割活性，其底物识别位点可以与底物形成3链反平行-折叠，从而催化切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。α-螺旋是维持蛋白酶K活性中心构象稳定性的主要结构。α-螺旋共含有90个氨基酸残基，占总残基数的1/3，并且大部分残基位于扩展的β-折叠结构中。这使得整个分子级数较低，变性熵较小，比变性热函极低，体现了酶的稳定性。分子中的两个二硫键和两个Ca2+也有助于三级结构的热稳定性。pH、温度、Ca2+、激活剂和抑制剂是影响蛋白酶K活性的主要因素。
蛋白酶K可用于消化各种蛋白质，包括制备用于脉冲电泳和蛋白质印迹的染色体DNA，以及去除DNA和RNA制备物中的核酸酶。蛋白酶K在核酸提取中的应用涉及食源性疾病的防治、农业病虫害的防治、法医学基因的鉴定与比较、分子生物学的实验研究等多个领域。应用对象包括原核生物、人体血液样本和组织、动植物组织、寄生虫、微生物等。蛋白酶K的使用条件，如工作浓度、缓冲液种类及浓度、处理时间、处理温度等条件因样品而异。
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