蛋白酶K是一种胞外内肤酶，由真菌Tritirachium album Limber合成。它是丝氨酸蛋白酶类中的一员，具有典型的催化三元组Asp39-His69-Ser 224。蛋白酶K具有高活性，是已知的内肽酶中最活跃的之一，可以水解天然和变性的蛋白质。
成熟的蛋白酶K由279个氨基酸组成，含有两个二硫桥和两个键合的钙离子，使其具有稳定的紧密结构。因此，与其他蛋白酶相比，蛋白酶K在极端pH值、高温、离液剂和去污剂等条件下具有更高的稳定性。蛋白酶K在高温（65°C）和宽pH范围（pH 7.5-12.0）下都表现出较高的稳定性。在存在变性剂如脲或SDS的情况下，其活性还可以提高。
蛋白酶K的这些特性使其在生物技术领域中具有广泛的应用，特别是在从粗提取液中分离核酸（DNA或RNA）以及在DNA分析中预处理样品方面。此外，蛋白酶K还可应用于蛋白质分析领域，如结构解析。
蛋白酶K偏好在疏水性胺基酸后的位置进行切割。该酶受钙离子的激活，尽管钙离子不会影响酶的活性，但它可以增强酶的稳定性。
在足够的酶浓度和作用时间下，蛋白质可以被完全水解。如果去除钙离子，蛋白酶K的稳定性会显著降低，但其水解活性仍然存在。蛋白酶K对钙离子有两个结合位点，都位于活性中心附近，但与催化反应无直接关联。
蛋白酶K在分子生物学领域经常被使用。在核酸制备过程中，蛋白酶K可以去除杂蛋白，并迅速使核酸酶失活，以避免其降解目标产物DNA和RNA。此外，蛋白酶K还具有其他优点，如在存在变性剂（如SDS、尿素、EDTA等）的情况下仍能保持活性，这与其他蛋白酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）有很大的不同。
1. 配制20-40 mg/mL的蛋白酶K储存液
将蛋白酶K干粉溶解于稀释缓冲液中，配制成40-80 mg/mL的原液。
【注】：稀释缓冲液配方为20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，1 mM CaCl2。
使用低蛋白吸附的0.22 μm滤器过滤除菌。
加入等体积无菌甘油，配制成含50%甘油的蛋白酶K储存液。
【注】：蛋白酶K储存液可在4℃保存1年。如需反复使用，需分装保存。
2. 根据核酸提取说明书添加适量的蛋白酶K储存液。
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