引言：
如何合成L-4-氯苯丙氨酸？本文将探讨合成L-4-氯苯丙氨酸的有效化学策略和技术路线。
简介：
L-4-氯苯丙氨酸，英文名称：4-Chloro-Phe-OH，CAS：14173-39-8，分子式：C9H10ClNO2，外观与性状：白色粉末，密度：1.336g/cm3，折射率：1.589，闪点：159.1℃。
合成：
Dai-Ichiro Kato等人开发了一种从外消旋体与表达单个外源基因的大肠杆菌细胞制备 l-4-氯苯丙氨酸的方法。通过由 d-氨基酸脱氢酶 (DadA) 和支链氨基酸转氨酶 (BCAAT) 催化的串联反应，通过其 d-形式的构型反转，以高光学产率获得 l-4-氯苯丙氨酸。虽然我们利用来自苜蓿根瘤菌 ATCC 51124 的基因构建了 BCAAT 质粒，但第一种酶 DadA 是来自大肠杆菌宿主细胞本身的 dadA 基因产物，它通过在生长培养基中添加 l-丙氨酸而被激活。具体如下：
（1）大肠杆菌BL21（DE3）中苜蓿中华根瘤菌SMc 02896基因的克隆和表达
将1.1kbp区域引入pACYCDuet-1载体的多克隆位点1，构建携带SMc 02896基因的质粒pACYCBCAAT。以苜蓿中华根瘤菌ATCC 51124基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得DNA片段（Sambrooket al. 1989）。PCR扩增时，使用两个合成寡核苷酸（5’-CGCGGATCCACAGATGACCGGTAGCGGTGAGCAGACTT-3’）和（5’-CCCAAGCTTCGCTCAG AACAGCCG GTC GAGCCAG-3’）分别作为正向和反向引物。每个引物中引入了包含BamH I限制位点（粗体）或Hind III限制位点（下划线）的突出序列（斜体）。使用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR。将获得的PCR产物引入pGEM-Teasy载体，用该载体转化大肠杆菌XL10-Gold。从该转化体中提取质粒，用BamH I和Hind III处理，并使用Ligation-Convenience Kit将DNA片段重组到pACYCDuet-1载体的BamH I/Hind III位点，从而形成质粒pACYCBCAAT。将此质粒导入大肠杆菌TOP10，并对其进行DNA序列确认。
用 pACYCBCAAT 转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，并在含有 20 mg mL 1 氯霉素（最高 OD /0.4）的 Luria/Bertanimedium（LB 培养基）中在 37℃下培养。然后，加入异丙基 β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，最终浓度为 0.6 mM）以诱导所需酶，并在 25℃下继续培养 6 小时。将所得培养液在 4℃下以 5,000 rpm 离心 10 分钟，并通过超声处理制备细胞提取物。通过 HPLC 测定转氨酶活性，测量在 L-谷氨酸和 PLP 存在下从 4-氯苯丙酮酸产生的 L-4-氯苯丙氨酸的量。
（2）从外消旋体生产 L-4-氯苯丙氨酸
重组细胞在基本 L-丙氨酸培养基中培养，该培养基由甘油 (0.2 g)、(NH4)2HPO4 (5 g)、L-丙氨酸 (5 g)、酵母提取物 (0.2 g)、Na2HPO4 (10 g)、K2HPO4 (2 g)、MgSO4/: 7H2O (0.3 g)、FeSO4/:7H2O (10 mg)、ZnSO4/:7H2O (8 mg)、MnSO4/:7H2O (8 mg) 和 1000 mL 蒸馏水 (pH 7.1) 组成，含有 20 mg mL-1 氯霉素，温度为 378C (最高 OD /0.4)。然后加入 IPTG（最终浓度为 0.6 mM）诱导酶，继续在 25℃下培养 20 小时。所得培养液在 4℃下以 5,000 rpm 离心 10 分钟，并用 100 mM 磷酸钾缓冲液（KPB，pH 7.0）洗涤。将洗涤后的细胞悬浮在含有 2.6 mM D,L-4-氯苯丙氨酸的 100 mM KPB 中（OD 1.5），并在 30℃下振荡进行反应。在适当的时间间隔取反应混合物的等分试样进行分析。
参考：
[1]Kato D I, Miyamoto K, Ohta H. Preparation of optically active 4-chlorophenylalanine from its racemate by deracemization technique using transformant Escherichia coli cells[J]. Biocatalysis and Biotransformation, 2005, 23(5): 375-379.
[2]https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/
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