引言：
合成L-环丙基甘氨酸是一项具有挑战性的化学任务，其作为重要的手性氨基酸在医药和化学领域中具有广泛的应用潜力。
背景：
L-环丙基甘氨酸是一种非天然脂肪族氨基酸，是制备治疗糖尿病的选择性GPR119 激动剂，生长素释放肽受体的大环调节剂，抗病毒剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，除草剂等重要手性构件。
目前，L-环丙基甘氨酸的合成主要通过化学和酶促方法进行不对称合成。1952年，Lowy等人首次利用不对称Strecker反应合成了外消旋环丙基甘氨酸，产率为9％，即L-环丙基甘氨酸。此后的研究表明，可以通过化学方法制备外消旋DL环丙基甘氨酸，然后利用酰基转移酶或木瓜蛋白酶进行手性分离水解酶促拆分反应，得到目标L-构型产物。Parker等人则采用了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)和甲酸脱氢酶(FDH)，结合NADH循环体系直接合成L-环丙基甘氨酸。在这两种生物酶催化法中，前者存在至少50%的粗产物未被利用，后者因NADH循环体系的高成本而限制其应用。为了进一步优化现有合成方法，探索生物酶法合成L-环丙基甘氨酸具有重要的研究价值。
合成：
李静等人构建了高效、绿色的非天然脂肪族氨基酸生物催化合成方法,利用转氨酶制备L-环丙基甘氨酸，具体如下：
1. 化学法合成环丙基乙酮酸钠
冰浴条件下，将环丙基甲基酮（10 mmol）和NaOH（12 mmol）依次加入到含有5 mL蒸馏水的250 mL圆底烧瓶中，搅拌至溶解。然后在5小时内缓慢滴加高锰酸钾溶液（3.16 g，20 mmol溶于80 mL去离子水中），得到紫红色溶液。将反应混合物在室温下搅拌24小时，在此期间形成大量深棕色固体。过滤后，在50°C下将滤液真空浓缩至10 mL，并用浓HCl将pH值调节为3。随后用CH2Cl2（20 mL×5）萃取。收集有机层，经无水Na2SO4干燥，浓缩后得到无色油状残余物。将油状残余物用40%NaOH溶液调节pH至8.0，减压浓缩除去一半溶剂，用无水乙醇重结晶，得大量白色固体，用90%乙醇（30 mL×3）洗涤，真空干燥，得白色固体1.23 g，收率为90.4%。
2. 构建 BCAT 重组菌
2.1 构建重组 pET-28a-BCAT 质粒
(1) 确定目的基因来源
选取大肠杆菌 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 来源的支链氨基转氨酶(BCAT)的基因序列(Gene ID：948278)NC_000913.3 作为目的基因序列。
(2) 获取目的基因
结合大肠杆菌 K-12 MG1655、BCAT 基因序列，利用 Primer premier 5.0 设计引物，引入限制性内切酶位点 BamHⅠ 和 XhoI，引物序列如下：
BCAT-F：5‘- GGGGGATCCATGACCACGAAGAAAGCTGA -3’ (BamH I)
BCAT-R：5‘- CCCCTCGAGTTATTGATTAACTTGATCTAACC-3 (Xho I)
PCR 扩增体系、条件如下：
反应体系：
PCR 循环条件：预变性：98 ℃，2 min；PCR 扩增过程：98 ℃变性 10 s，65 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 10 s，重复此过程 30 次循环；72 ℃延伸 2 min。
(3) 纯化目的基因
使用 PCR 产物柱纯化试剂盒，纯化扩增的目的基因 PCR 产物。
(4) 提取质粒 pET-28a
使用质粒小提试剂盒提取，具体步骤参考试剂盒说明书。
(5) 目的基因和载体酶切
(6) 胶回收
采用 DNA 凝胶回收试剂盒回收全部酶切产物，取 5 μL 产物进行 1% Agarose电泳检测。
(7) 连接
将目的基因片段与载体连接，构建重组质粒，即为 pET-28a-BCAT。连接条件为：16 ℃保温 16 h 以上。体系如下，
(8) 转化
通过热激法将连接产物转化至 E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。
转化流程：
A. 将连接产物置于 65 ℃水浴锅中，先灭活 10 min，冰浴放置 5 min；
B. 取 E. coli BL21(DE3)感受态细胞 100 μL，分装为 50 μL/管；分别向其中加入 5μL、10μL 连接产物，轻轻混匀，放置冰上 30 min (期间每 10 min 取出轻弹混匀)；
C. 热激(关键步骤)：42℃水浴锅中，水浴 45 s，冰上静置 5 min；
D. 加入 500 μL LB 培养基(不含抗生素)，37 ℃，170 r/min，活化 45 min；
4000 r/min，离心 5 min。离心后吸出 200 μL 上清液，重新混悬，均匀涂于平板
上。
E. 将平板置于 37℃，培养 14-16 h，得到重组 BCAT 单菌落。
2.2 诱导表达 pET-28a-BCAT 重组蛋白
将目的单克隆菌株接种于 3 mL LB 卡那青霉素液体培养基中，置于 37 ℃ 、200 rpm 摇床中振荡培养 12 h；随后，将 1 %接种量的种子液接种于 30 mL LB 液体培养基中(终浓度 50 μg/mL 卡那青霉素)，37 ℃ 、200 rpm 摇床中培养；当 OD600约为 0.5-0.6 时，加入诱导剂：终浓度 0.4 mM 的 IPTG，调温至 28 ℃，诱导 6 h后，取菌液，12000 rpm、1 min 条件下收集菌体，超声波破碎后 SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达及分布情况。
2.3 BCAT 催化活性检测
催化活性检测体系为：5 mL 50 mM Tris-HCl 缓冲液反应体系(pH 8.0)，含有：BCAT 全细胞(5 mg)，环丙基乙酮酸钠(50 mM)，L-Glu(60 mM)，0.05% PLP(w/v)以及 0.05%吐温-80(w/v)，37℃ 200 rpm 振荡反应，HPLC 检测产物 L-环丙基甘氨酸。
参考：
[1]李珊珊. 生物催化不对称合成非天然氨基酸（S）-2-环丙基甘氨酸[D]. 重庆医科大学, 2020. DOI:10.27674/d.cnki.gcyku.2020.001522.
[2]李静. 转氨酶催化合成非天然脂肪族氨基酸[D]. 南京大学, 2020. DOI:10.27235/d.cnki.gnjiu.2020.002931.
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