本研究旨在探讨合成与应用5-氟乳清酸的方法，希望通过这项研究为相关领域的合成化学和应用研究提供新的思路。
背景：5-氟乳清酸，淡黄色结晶，熔点258-262℃。溶于DMSO，微溶于甲醇、乙醇及其他溶剂。5-氟乳清酸是一个化学中间体，具有重要的经济价值。现有的制备方法较少，设备要求较高，且制备步骤较为复杂，对于5-氟乳清酸的制备效率较低。
1. 合成优化：
包括以下步骤：S1：氟乙酸酯与草酸酯在碱性条件下发生缩合反应，缩合反应温度为0～50℃，反应时间为1～10小时；S2：步骤S1中缩合反应后的产物再与O-甲基异脲盐发生环合反应得到2-二甲氧基-4-羟基-5-氟-6-甲酸酯嘧啶；S3：2-二甲氧基-4-羟基-5-氟-6-甲酸酯嘧啶与盐酸发生水解反应，得到5-氟乳清酸。具体实验操作如下：
（1）2-二甲氧基-4-羟基-5-氟-6-甲酸乙酯嘧啶的合成：
在干燥的反应瓶中依次加入10mL甲苯、17g固体甲醇钠、72g草酸二乙酯，在充分搅拌下滴加10.6g氟乙酸乙酯，控制温度30℃，搅拌反应2小时后。在35℃下加入28％液体甲醇钠4g和40g液体O-甲基异脲素硫酸盐反应8小时后，加入100mL水，搅拌分层，甲苯层分别用20mL水洗涤两次，合并水相。水相用盐酸调节pH＝5～6，析出白色固体，冷却至室温，过滤，洗涤，干燥，得2-二甲氧基-4-羟基-5-氟-6-甲酸乙酯嘧啶，产率62％，纯度为98.5％。
（2）5-氟乳清酸的合成：
在干燥的反应瓶中依次加入2。14g2-二甲氧基-4-羟基-5-氟-6-甲酸乙酯嘧啶和15mL水，加热到60℃，开始慢慢滴加2g30％的盐酸，进行水解反应。反应4h后，过滤、洗涤、干燥，得5-氟乳清酸，产率79％，纯度为99.2％。
此工艺路线步骤短，操作简单，原料易得，成本低，易于纯化，适合工业化生产。
2. 应用：
（1）筛选米曲霉尿嘧啶营养缺陷型突变体
米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物，但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核，并且对多种抗性药物具有抗性，导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选标记。尿嘧啶营养缺陷型是米曲霉转化中最常用的一种营养缺陷型标记，其筛选标记基因pyrG编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶为尿嘧啶的前体尿苷合成所必需。秦坤海等人以米曲霉3.042为背景，利用紫外线诱变和5-氟乳清酸(5-FOA)胁迫筛选获得5株尿嘧啶营养缺陷型菌株，经DNA测序5株菌株均为pyrG基因不同位点突变，确定为尿嘧啶营养缺陷型。
（2）筛选金针菇尿嘧啶营养缺陷型菌株
卢绪志等人通过原生质体单核化技术从金针菇双核体菌株‘G1’中获得原生质体单核化菌株‘DG1-1’，根据5-氟乳清酸敏感性试验，可知当5-氟乳清酸浓度为0.5g/L时，‘DG1-1’菌株菌丝生长完全受到抑制。采用原生质体紫外诱变技术，在含有5-氟乳清酸的筛选培养基上筛选获得了1株尿嘧啶营养缺陷型的突变菌株。
（3）构建里氏木霉RL-P37尿嘧啶营养缺陷型菌株
里氏木霉(Trichoderma reesei)RL-P37作为纤维素酶高产菌，被广泛地应用在工业蛋白的生产过程。从基因水平对工业菌株进行分子改造已经成为提升工业菌株生产性状的重要手段。因此，亟需构建适用于基因敲除以及外源蛋白表达的营养缺陷型菌株，特别是可用于基因无痕敲除的尿嘧啶营养缺陷型菌株。陈永等人以潮霉素为标记，成功构建了里氏木霉RL-P37尿嘧啶营养缺陷型菌株，并得到Southern验证。该菌株在含有1.5 mg/m L 5-氟乳清酸、2 mg/m L尿苷的MM培养基中可以正常生长，并且在不含有尿苷的MM培养基上不能生长。此外，利用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的pyr4基因对该突变体进行了回补。里氏木霉RL-P37尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建为该菌纤维素酶表达和分泌的机理研究以及后续产酶性能分子改造奠定了物质基础。
参考文献：
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[3]陈永,林良才,肖冬光等. 里氏木霉RL-P37尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建 [J]. 中国酿造, 2014, 33 (12): 58-62.
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