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什么会出现组化结果与PCR、werstern结果相反?

请各位老师看下我的免疫组化的结果,做的是胃的癌旁组织,目的蛋白表达在胞浆,少量胞核,看图也基本符合。组化用的是Envsion二步法,一抗购于abnove,是多抗,二抗用的是doko的试剂盒,用的3%H2O2 10min抑制内源性过氧化物酶,没有用血清封闭,。不明白原因,是因为一抗是多抗吗?但werstern也是用的这个抗体,同一批次,但从组化的结果上看该蛋白在癌旁表达水平应该不低,为什么做PCR和Werstern的结果都很低呢?并且相比癌旁组,癌组织的目的基因PCR和Werstern表达很高,而组化结果却不比癌旁高,为什么组化的结果会出现与PCR和Werstern的结果相反呢?
下图是癌旁组织的免疫组化图:



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共3个回答
wb应该比免疫组化定量准确一些
1.一般来讲:组化和WB的结果应该是一致的,因为都是蛋白水平的检测,一个是切片的组织,而另一个是匀浆后的组织。但是,二者的结果也可以是不同的,比如可能的原因有
(1) 免疫组化的结果是假的。比如non-specific. 建议用另外一个抗体试试。还有找找文献中别人做的结果或推测。
(2)在WB试验中,材料的准备过程,你的蛋白被降解了。或者你的蛋白大么,转膜时间够长么?
(3)因为组织有很多其他细胞,是不是你的蛋白在其中某种细胞中表达比较低,而你的材料中含有这种细胞比较多。因为免疫组化可能放大了你的蛋白信号。纯化你要的细胞。
(4)如果在某个组织中,只有某一类型的细胞表达抗原,该类型细胞在该组织中又较少。这时虽然在单个的细胞内抗原表达量足够高,能通过免疫组化检测到,但有时上样量受限,western也无法检测了。

WB和pcr的表达:
mRNA与蛋白表达水平不一致很正常,其实mRNA的表达与蛋白的表达水平的线性关系只有0.4~0.5左右。因为影响蛋白质半衰期的因素很多,如各种翻译后的修饰等都可能延长或者缩短其半衰期。 从DNA→mRNA→蛋白质,存在着转录水平、翻译水平、翻译后水平这三个层次的调控,从mRNA角度考虑实际上仅包括了转录水平调控,并不能全面代表蛋白质表达水平。组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好,尤其对于低丰度蛋白质来说,相关性更差。
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