为了获得大量融合 His Tag 的重组蛋白用于开发复性方法，我们利用PCR技术扩增了大肠杆菌DH5α染色体DNA中苹果酸脱氢酶的编码基因、质粒pEGFP-C1中增强型绿色荧光蛋白的目标基因以及牛胰腺全DNA组中核糖核酸酶A的DNA。然后，我们通过酶切位点Bam HI和HindIII将这些基因与质粒载体pET28a连接，构建出重组质粒pET28a-MDH、pET28a-EGFP和pET28a-RNase A。
将重组质粒转入E.coli BL21（DE3）中，得到可以启动T7 promoter表达目标蛋白质的基因工程菌。通过优化表达菌的培养时间和诱导时机，我们确定了最佳诱导条件。对表达产物的分析发现，目标蛋白主要以包涵体形式存在，但也有部分可溶蛋白表达。经过SDS-PAGE凝胶电泳胶密度面积扫描分析，我们得到了目标蛋白的产量。
由于表达产物带有6个His Tag，我们利用固定化金属亲和色谱（Chelating SepharoseTM Fast Flow）对表达产物进行了亲和分离和复性的前期实验。结果表明，固定化金属亲和色谱能够较好地吸附可溶性表达蛋白质和经脲变性的包涵体蛋白质，并且可以通过结合/洗脱缓冲液有效洗脱，实现较好的分离纯化效果。
[1] 融合 His Tag 重组蛋白的基因克隆、表达及亲和纯化
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