本文将探讨如何测定吉非替尼中相关杂质4-氯-3-氟苯胺，旨在为相关领域的研究人员提供参考思路和启示。
简述：4-氯-3-氟苯胺，英文名称：4-Chloro-3-fluoroaniline，CAS：367-22-6，分子式：C6H5ClFN。4-氯-3-氟苯胺用于合成甲基5-氯-4-氟-1H-吲哚-2-羧酸甲酯，这是HIV非核苷逆转录酶的磷酸吲哚抑制剂的关键中间体。4-氯-3-氟苯胺还用于合成3-去氯-4-去氟-4-氯-3-氟吉非替尼，这是酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的杂质。
测定：
吉非替尼是一种选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗铂剂化疗和多烯紫杉醇化疗均失败的局部晚期或转移性非小细胞（型）肺癌，是首个应用于肺癌治疗的靶向药物。该药物的合成主要原料是3-氯-4-氟苯胺，而在合成3-氯-4-氟苯胺的过程中产生3，4-二氟苯胺和4-氯-3-氟苯胺作为附属产物。由于这些附属产物具有基因毒性，因此在吉非替尼的生产过程中需要控制这些基因毒性杂质的含量。
王珊珊等人建立了液相色谱-串联质谱法测定吉非替尼中基因毒性杂质的含量。方法具体为:采用Accucore C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.6μm),以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(70:30)为流动相,流速0.3 mL·min-1,柱温30℃;采用ESI离子源正离子模式,多反应离子监测(MRM)模式下选择离子对m/z130.1→83.1(3,4-二氟苯胺)和m/z146.0→111.0(4-氯-3-氟苯胺)进行测定。
基因毒性杂质3,4-二氟苯胺和4-氯-3-氟苯胺的线性浓度范围为124 ng·mL-1,且线性关系良好(r=0.999 4、r=0.999 2);检测限为0.2 mg·kg-1,定量限为0.5 mg·kg-1;3,4-二氟苯胺和4-氯-3-氟苯胺的精密度试验的RSD(n=6)分别为2.3%和2.0%;杂质3,4-二氟苯胺低、中、高浓度的加标回收率(n=3)分别为99.4%、97.0%、105.5%,RSD=8.2%、5.1%、1.7%;杂质4-氯-3-氟苯胺低、中、高浓度的加标回收率(n=3)分别为102.0%、98.6%、106.0%,RSD分别为3.9%、7.9%、2.4%。经检测,3批吉非替尼供试品中3,4-二氟苯胺均未检出,批号2吉非替尼样品中4-氯-3-氟苯胺有少量检出,但低于样品的定量限(<0.5 mg·kg-1)。该方法操作简便,结果可靠,经方法学验证,可用于吉非替尼药物中基因毒性杂质3,4-二氟苯胺和4-氯-3-氟苯胺含量的同时测定。实验方法具体为:
（1）色谱条件：
采用色谱柱Accucore C18（2.1 mm× 100 mm，2.6 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液（70∶30）为流动相，流速0.3 mL·min-1，柱温30 ℃，进样体积2 μL。
（2）质谱条件：
采用ESI离子源正离子模式，多反应离子监测（MRM）模式下选择离子对m/z 130.1→83.1（3，4-二氟苯胺）和m/z 146.0→111.0（4-氯-3-氟苯胺）；解簇电压90 V（3，4-二氟苯胺）、76 V（4- 氯-3-氟苯胺）；解离能量32 V（3，4-二氟苯胺）、26 V（4-氯-3-氟苯胺）；入口电压10 V；出口电压 12 V；碰撞气压力Medium；气帘气压力1.03 MPa；雾化压力0.38 MPa；辅助加热气压力0.38 MPa；离子喷雾电压5.5 kV；离子源温度500 ℃。
（3）对照品溶液：
精密称取3，4-二氟苯胺、4- 氯-3-氟苯胺对照品各约10.01 mg，置100 mL量瓶中，加稀释剂乙腈-水（50：50）溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，用稀释剂乙腈-水（50：50）稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为 1 μg·mL-1对照品储备液；精密量取1 mL，置10 mL 量瓶中，用稀释剂乙腈-水（50：50）稀释至刻度，摇匀；精密量取12 mL，置100 mL量瓶中，用稀释剂乙腈-水（50：50）稀释至刻度，摇匀，配成浓度为12 ng·mL-1的对照品溶液。
（4）供试品溶液 精密称取吉非替尼供试品约
20.03 mg，置10 mL量瓶中，用稀释剂乙腈-水（50：50） 振摇使溶解并稀释至刻度，取1 mL置2 mL离心管中，12 000 r·min-1离心10 min后取上清液，配制成浓度为2 mg·mL-1的吉非替尼供试品溶液。
参考文献：
[1]王珊珊,宁凡盛,王晓利等.HPLC-MS/MS法分析吉非替尼中痕量基因毒性杂质[J].药物分析杂志,2017,37(07):1309-1313.DOI:10.16155/j.0254-1793.2017.07.23
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