如何使用WESTERN及IP细胞裂解液(无抑制剂)进行细胞裂解? ¹

细胞裂解是从细胞中提取总蛋白的重要步骤。WESTERN及IP细胞裂解液采用一种非变性裂解方法，可以有效地裂解细胞并获得总蛋白的裂解液。该裂解液可以用于PAGE电泳、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等实验。它由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100和低浓度sodium pyrophosphate等组成，不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并能保持蛋白间的相互作用。使用WESTERN及IP细胞裂解液(无抑制剂)得到的蛋白可以使用BCA蛋白定量试剂盒进行测定。

操作步骤

贴壁培养细胞

1、将WESTERN及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择是否添加蛋白酶抑制剂。

2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入100~200L裂解液的比例，加入WESTERN及IP细胞裂解液。使用移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5秒内，细胞就会被裂解。

4、进行10000~12000g离心3~5分钟(如果有冷冻离心机，4℃离心效果更佳)，取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

悬浮培养细胞

1、将WESTERN及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择是否添加蛋白酶抑制剂。

2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入100~200L裂解液的比例，加入WESTERN及IP细胞裂解液。通常6孔板每孔细胞加入100吨裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当增加裂解液的用量到150~200L，再用手指轻弹以充分裂解细胞。裂解后应没有明显的细胞沉淀。

4、进行10000~12000g，4℃离心3~5分钟(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。

主要参考文献

[1] 张华昌，PTEN基因在唾液腺腺样囊性癌中的表达研究。《重庆医科大学》