亚叶酸是还原型叶酸（folate）的一种特殊形式，给予CFD的儿童高剂量亚叶酸干预，可以改善他们的神经和发育异常。亚叶酸杂质E是亚叶酸制备过程中的杂质，可由(6S)-5-ForMyl-5,6,7,8-tetrahydropteroic Acid一步制备得到。
根据EP 0 600 460 B1制备了445 mg（1 mmol）（6S）-THF，880 mg（5 mmol）抗坏血酸和875 mg（5 mmol）N-甲酰基-（L）-谷氨酸将其加到装有磁力搅拌器，氮气入口管和温度计的25毫升三颈烧瓶中。 N-甲酰基-（L）-谷氨酸是根据H.Tabor，A.H.Mehler，J.Biol.Chem.Soc，1992制备的。在搅拌的氮气氛下，将5mL的100mM磷酸钾缓冲液添加至上述混合物，其pH值为6.7。将20％的NaOH逐滴添加至所得的悬浮液中，直到获得pH值为6.7的均匀溶液。为了除去痕量的氧气，然后将反应容器抽真空并用氮气吹扫。将该程序重复两次。然后加入0.35U的重组单功能谷氨酸甲酰基转移酶，并溶于0.32ml的pH 6.7的100mM磷酸钾缓冲液中。然后再次进行3个抽真空和氮气吹扫循环。
将该反应混合物的温度升至40℃，并搅拌总共72小时。使用“反相”柱通过HPLC监测甲酰化反应的进程。在上述的72小时反应时间内，分四部分添加另外的100mg N-甲酰基-（L）-谷氨酸（0.57mmol）。 HPLC色谱图的末端进行的反应表明，所得（6S）-N（5）-甲酰基-THF的纯度为95.07％。然后将反应混合物冷却至5℃的温度。加入18％HCl并搅拌直到达到3.0的pH值。同时加入酸产生白色固体。为了完成沉淀，将得到的悬浮液在5℃的温度下再搅拌1小时。通过过滤分离得到的固体，然后将其重悬于2ml冷水中，并再次过滤。 HPLC色谱图中所得的固体（6S）-N（5）-甲酰基-THF显示纯度为96.88％。如挪威专利NO.172492中所述，可以例如通过制备相应的Ca 2+盐来进一步纯化产物。
[1] From PCT Int. Appl., 2007082402, 26 Jul 2007
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