青霉素-链霉素溶液是一种溶于0.85%NaCl溶液的药物，每毫升溶液含有青霉素10000单位和链霉素10000μg。这种溶液可以用于培养人表皮干细胞。
1. 将取下的人包皮组织用0.5%碘伏浸泡一分钟，然后用PBS彻底漂洗两次，直到肉眼观察不再有碘伏着色。包皮组织来自第三军医大学西南医院泌尿外科12～20岁行包皮环切术无泌尿系感染等疾病患者（患者知情同意）。
2. 在无菌条件下，尽量修剪掉皮下脂肪组织，将组织修剪为约0.5cm×1cm大小的皮片。
3. 加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块，4℃消化12～16小时。中性蛋白酶Ⅱ的配置及使用方法为，将0.5g的Dispase II（Roche）溶入100mL的0.1M PBS中，4℃过夜，再搅拌促溶解，用0.22um过滤，分装10ml/瓶，保存在-20℃。
4. 吸弃中性蛋白酶Ⅱ溶液，用PBS清洗后用眼科镊轻轻牵扯组织，分离表皮与真皮。分离表皮与真皮层时需特别注意保护表皮完整性，尽量避免真皮成分脱落，以防止成纤维细胞污染。
5. 收集并剪碎表皮组织，加入0.25%胰蛋白酶溶液于37℃消化10分钟。
6. 加入含10%小牛血清的RPMI1640终止消化后，吹打成混悬液，通过200目筛网研磨过滤。
7. 在1000rpm/min的条件下离心5分钟，以收集细胞。
8. 弃去上清液后，用PBS洗涤一次。
9. 加入K-SFM并轻柔吹打制成2.5×105/mL的单细胞悬液，接种4mL单细胞悬液于预先包被了IV型胶原的25cm2培养瓶中，37℃静置10分钟。无血清角质细胞专用培养基K-SFM的配置方法为，K-SFM(Invitrogen10725)：加入rEGF：(0.1～0.2)ng/mL，BPE:(20～30)μg/mL；加入CaCl20.05mM；双抗（青酶素-链酶素溶液）100U/mL。IV型胶原包被培养瓶或培养板的方法为，按照10μg/cm2计算，将适量0.1mg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养瓶或培养板中，保证液面能够充分覆盖培养瓶或培养板底部即可。放置在4℃冰箱中过夜（约12小时）或更长时间。使用前应用PBS液清洗IV型胶原包被的培养瓶或培养板。
10. 吸去上层细胞悬液，用PBS轻轻漂洗两次，加入适量4mL的K-SFM。
11. 在37℃、5%CO2的孵箱中进行常规培养。
12. 次日更换细胞培养液，继续常规培养，每2天换液1次。
13. 待细胞生长密度为70～80%时，进行细胞传代。传代步骤如下：
a. 吸弃原细胞培养基，用PBS洗涤2次。
b. 加入0.25%胰酶1～1.5mL，37℃、5%CO2孵箱孵育6～10分钟，当镜下观察到大部分细胞脱落时终止消化。
c. 加入含10%小牛血清的RPMI1640终止消化后，吹打成单细胞混悬液。
d. 移入离心管中，在1000rpm/min的条件下离心5分钟，以收集细胞。
e. 按照1︰5的比例加入K-SFM培养液，进行常规培养，共传代8次。
通过以上方法培养的人表皮干细胞具有快速、高效、方法简便、细胞活性高、细胞干性强等特点。这种方法能够将人表皮干细胞传代至少8代，极大提高了细胞扩增倍数，并且能够控制细胞分化，使细胞成分单一，具备了应用到临床上的基本条件。
[1] 青霉素-链霉素溶液（100×）说明书
[2] CN201410112277.3 人表皮干细胞的分离与培养方法
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