本文将讲述如何测定替格瑞洛中基因毒性杂质N，N-二乙基苯胺，旨在为分析化学和医药领域提供相关的参考思路和实验支持。
背景：N，N-二乙基苯胺为淡黄色油状液体，可用于制取偶氮染料、三苯甲烷染料等，也是合成药物、彩色影片显影剂的重要中间体，其应用十分广泛。传统的合成方法大多在高温和加压下由苯胺和溴乙烷反应得到。
替格瑞洛主要用于急性冠状动脉综合征患者，包括接收药物治疗和经皮冠状动脉介入（PCI）治疗的患者，降低血栓性心血管事件的发生率。替格瑞洛的工艺杂质N，N-二乙基苯胺，被视为遗传毒性杂质。
1. 测定：
王庆鹏等人建立了液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）法测定替格瑞洛中基因毒性杂质N，N-二乙基苯胺。方法具体为：采用色谱柱Ultimate® UHPLC XB-Phenyl（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A为0.1%甲 酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱，流速为0.3 ml/min，柱温为40℃；采用AB SCIEX ExionLC-QTRAP5500三重四级杆串联离子阱液质联用仪，电喷雾离子源（ESI+）、以监测模式为多反应监测模式 （Multiple Reaction Monitoring，MRM）二级质谱MS/MS，定量离子对为150.2→160.0（m/z，Da）进行检测。N，N- 二乙基苯胺在0.20～15.80 ng/ml浓度范围内呈良好线性关系，线性方程为y=1360 211.0060 x+62 126.0011 （r=0.9999）；检测限为0.06 ng/ml；定量限为0.2 ng/ml。平均加样回收率95.3%，RSD=0.84%（n=9）。该方法简便准确可靠，可用于替格瑞洛原料药中N，N-二乙基苯胺的含量测定。实验方法如下：
（1）色谱条件
液相色谱柱：Ultimate® UHPLC XB-Phenyl（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速 0.3 ml/min；以0.1% 甲酸水溶液为流动相A，以0.1% 甲酸甲醇溶液为流动相B，梯度洗脱（0～1.5 min，5% B→ 70% B；1.5～10.0 min，70% B；10.0～10.5 min，70%B→95%B；10.5～18.0 min，95%B；18.01～22.0 min，5% B）；柱温：40℃；进样体积：5 μl；供试品测定，于0.5 min时通过阀切换将流路切入质谱仪进行检测，于6.5 min时将流路切至废液， 避免高浓度替格瑞洛进入质谱仪而污染仪器。
（2）质谱条件
电喷雾离子源（electron sprayionization， ESI），正离子模式采集；多反应离子监测模式 （multiple reaction montoring，MRM），定量离子对 150.2/106.0；电喷雾电压（IS）：5500 V；涡旋离子喷雾温度：550℃；气帘气（CUR）：40；碰撞池气体：Medium；雾化气（Gas1）：55；辅助气（Gas2）： 60；入口电压（EP）：10 V；碰撞室出口电压（CXP）：13 V；碰撞能（CE）：34；去簇电压（DP）：90 V；驻留时间：100 ms。
（3）溶液配制
对照品贮备溶液：对照品贮备溶液Ⅰ：称取 N，N-二乙基苯胺对照品适量，精密称定，加入甲醇适量，使溶解，并用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）] 定量稀释制成每1 ml中约含160 ng的溶液。对照品贮备溶液Ⅱ：精密量取对照品贮备溶液Ⅰ适量，用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀释 制成每1 ml中约含8 ng的溶液。
对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液Ⅰ适量，用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀释制成每1 ml中约含8 ng的溶液。
供试品溶液：取替格瑞洛约20 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，加入稀释剂[甲醇-乙腈-水 （1∶1∶2）]适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。
2. N，N-二乙基苯胺的合成：
（1）O/W微乳体系单相区的确定
将0.25g CTAB和0.15mL正丁醇混合后，加入不同量蒸馏水，配制一系列二组分体系，分别在这些体系中缓慢滴加苯胺，根据体系清浊变化确定O/W微乳体系单相区的边界。
（2）微乳体系中合成N，N-二乙基苯胺方法
在上述微乳相区中选取一点(苯胺4.72%，水94.41%，CTAB+正丁醇0.87%)配制成微乳液。将此微乳液放入装有电动搅拌器和回流冷凝管的三口烧瓶中， 加入NaOH后，在搅拌状态下，用滴液管缓慢滴加溴乙烷，在整个反应过程中始终保持反应液澄清透明，保证在微乳体系中实施反应。反应几小时后， 冷至室温，分出油层。水层用乙醚数次萃取，萃取液与油层混合，混合物用无水硫酸镁干燥3小时，蒸出乙醚。残留物与等体积的醋酸酐混合除去游离的仲胺。用10%的盐酸洗涤至酸性pH等于1至2，分出乙醚、N-乙基苯胺后，再用25%氢氧化钠溶液碱化到pH等于11至12。分离油层，水层再用30mL乙醚萃取2次， 将萃取液与油层混合，用无水硫酸镁干燥3小时，蒸出乙醚，蒸馏剩余物，收集215～216℃的馏分即得到N，N-二乙基苯胺。
参考文献：
[1]王庆鹏,陈晓英,骆献丽等. LC-MS/MS法测定替格瑞洛原料药中的N,N-二乙基苯胺 [J]. 中国医药科学, 2021, 11 (21): 79-82.
[2]张莹琪,李冰. 在微乳体系中合成N,N-二乙基苯胺 [J]. 染料与染色, 2006, (03): 37-38+28.
[3]郑海涛,陶克毅. 气相法合成N,N-二乙基苯胺 [J]. 石油化工, 2001, (11): 844-846.
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