本文将讲述关于DBAT非天然底物制备巴卡亭Ⅲ的微生物细胞研究，这部分研究可为未来紫杉醇微生物细胞工厂化生产奠定基础。
简述：巴卡亭Ⅲ是紫杉醇的骨架结构，是紫杉醇生物合成途径中重要的前体物质，也是目前最常用的化学半合成法生产紫杉醇的起始原料之一，对紫杉醇的工业化生产非常重要。它也是从红豆杉中分离出来的萜类次级代谢产物，其 IUPAC（International Unionof Pure and Applied Chemistry，国际纯粹与应用化学联合会）化学命名为（2β，5α，7α，10α，13β）-4，10-Diacetoxy-1，7，13-trihydroxy-9-oxo-5，20-epoxytax-11-en-2-ylbenzoate，分子式是 C31H38O11，摩尔质量为 586.62677 Da，化学结构如下图所示。
1. 研究进展：
近年来，巴卡亭Ⅲ的医疗用途也逐步被挖掘（Andreu et al., 2001；Chatterjee et al.,2001；Miller et al., 1999），Young-Hee Lee 等先后在 2011 年和 2014 年利用小鼠模型揭示巴卡亭Ⅲ能增强树突状细胞中因主要组织相容性复合体受限（ majorhistocompatibility complex restricted，MHC-restricted）的抗原呈递以及具备一定的抗肿瘤免疫调节活性（Lee et al., 2011；Lee et al., 2014）。2016 年，王红岗发现巴卡亭Ⅲ对慢性阻塞性肺病模型大鼠转化生长因子 β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）的表达有影响作用（王红岗，2016）。2019 年江南大学无锡医学院吴亚先博士团队揭示了巴卡亭Ⅲ通过抑制 TGF-β1 的产生和 TGF-β1 诱导的成纤维细胞分化来改善博来霉素诱导的肺纤维化。巴卡亭Ⅲ的细胞毒性比紫杉醇低 100-1000 倍，而在许多细胞类型中却能以较低的剂量发挥免疫调节活性，因此，巴卡亭Ⅲ有望成为未来重要的治疗药物（Nie et al., 2019）。
无论是在紫杉醇的制备中作为起始原料，还是在治疗疾病中作为低剂量低毒性的治疗药物，巴卡亭Ⅲ都扮演着重要的角色。因此，巴卡亭Ⅲ的工业化生产变得愈发重要。尽管在红豆杉植物中的含量高于紫杉醇，但直接从植物中提取会对环境造成一定影响。作为紫杉醇的骨架结构，巴卡亭Ⅲ的化学全合成难度与紫杉醇相当，需要的化学药剂昂贵且最终产率不高。
从巴卡亭Ⅲ至紫杉醇的步骤只需要 4 个化学反应，且得率高达 80%，比 10-DAB更适合成为紫杉醇半合成的原料（Baloglu et al., 1999）。10-DAB 作为可再生树叶原料用于半合成紫杉醇，也可用于合成巴卡亭Ⅲ。在紫杉醇的生物合成途径中，10-DAB合成至紫杉醇的第一步就是生成巴卡亭Ⅲ。10-DAB 利用化学法合成巴卡亭Ⅲ需要使用化学试剂对 C7 位进行保护，而后还要脱去保护基，为整个生产过程带来繁琐且高成本的步骤（Denis et al., 1988）。
2. 合成
利用已被成功克隆的 DBAT 酶生物催化法能一步达到合成巴卡亭Ⅲ的目的，反应方程式为：10-DAB + acetyl-CoA? CoA + baccatin Ⅲ。以下为高效合成巴卡亭Ⅲ的技术路线：
黄佳俊等人研究了巴卡亭Ⅲ在微生物体内的合成，结合计算机的辅助技术，分别开展了 DBAT 酶非天然底物拓展的探究，以及通过蛋白质半理性设计改善 DBAT 酶的热稳定性，结合代谢工程思路改善乙酰辅酶 A 在微生物细胞内的利用效率，大大提高巴卡亭Ⅲ的合成量，最后将 dbat 基因整合至大肠杆菌染色体中实现无抗性无诱导的微生物细胞工厂化一步合成巴卡亭Ⅲ。以下为高效合成巴卡亭Ⅲ的技术路线：
结果：（1）以 N-乙酰氨基葡萄糖作为乙酰基底物时，开放式全细胞-破碎前系统反应获得巴卡亭Ⅲ生成量为 2.25 ± 0.39 μM；体内合成反应获得巴卡亭Ⅲ生成量为17.98 ± 0.35 μM；大肠杆菌表达系统 BL21（DE3）/pET-32a-DBAT 为最适用于合成巴卡亭Ⅲ的表达系统。
（2）利用突变株 S189V，在 25℃下以葡萄糖作为碳源的体内合成巴卡亭Ⅲ反应中，巴卡亭Ⅲ的生成量为 24.72 ± 0.28 μM，是野生型菌株的 4.25 倍。优化发酵液的碳源以提高细胞代谢过程中乙酰辅酶 A 通往合成巴卡亭Ⅲ的分流，结果表明以甘油作为碳源时巴卡亭Ⅲ的生成量提高至 44.60 ± 0.94 μM（提高 1.8 倍）。通过改变宿主进一步提高乙酰辅酶 A 的利用率，结果表明代谢工程改造菌 N05 积累乙酰辅酶 A 的能力比 BL21（DE3）更强。以 N05 作为发酵宿主，同等甘油添加量下巴卡亭Ⅲ的生成量提高至54.51 ± 2.24 μM，持续增加甘油添加量，当甘油添加量达到 20 g/L 时，巴卡亭Ⅲ的生成量达到 73.93 ± 0.05 μM，是 DBAT 酶改造以及宿主改变和碳源优化前的 12.7 倍。
（3）利用染色体工程将 dbat 基因以及突变型基因（s189v 和 p37q）分别整合至大肠杆菌 BW25113 和 N05 的染色体中，使基因得到稳定遗传。HPLC 检测结果显示，6个工程菌均能产生巴卡亭Ⅲ，其中 N05S01（N05, attP HK ::[P T5 -s189v o ]）发酵获得的巴卡亭Ⅲ生成量最高，为 45.34 ± 0.32 μM，实现了微生物细胞工厂化一步制备巴卡亭Ⅲ。
参考文献：
[1]黄佳俊.DBAT非天然底物制备巴卡亭Ⅲ的微生物细胞工厂创制研究[D].华南农业大学,2020.DOI:10.27152/d.cnki.ghanu.2020.000017.
1
