如何制备alpha-淀粉酶? ¹

alpha-淀粉酶是一种广泛存在于生物界的酶，能够催化淀粉的水解反应，产生麦芽糖、麦芽三糖和α糊精。它在饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和医药等行业有着广泛的应用。

制备载体pxmj19-aph213

步骤1：扩增aph213基因

使用引物aph213F和aph213R从载体xk99e上扩增aph213基因。PCR条件为：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min，共35个循环；72℃ 7min。

上述引物的设计使得aph213基因扩增过程中，在aph213基因上游形成EcoRV切点、下游形成HindIII切点。

步骤2：构建载体pxmj19-aph213

将扩增得到的aph213基因经过EcoRV和HindIII酶切，连接到经过相同酶切的载体pxmj-19上，得到载体pxmj19-aph213。

扩增和改造枯草芽孢杆菌的alpha-淀粉酶基因

使用引物AmyF和AmyR从枯草芽孢杆菌的基因组上扩增alpha-淀粉酶基因。PCR条件为：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，共35个循环；72℃ 7min。

上述引物的设计使得alpha-淀粉酶基因扩增过程中，在alpha-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列、下游形成组氨酸标签。

构建重组载体pxmj19-aph213-amy

将扩增得到的alpha-淀粉酶基因经过XhoI和HindIII酶切，连接到经过相同酶切的载体pxmj19-aph213上，得到重组表达载体pxmj19-aph213-amy。

构建重组菌

将重组表达载体pxmj19-aph213-amy转入大肠杆菌中进行预扩增，培养基为LB培养基，氯霉素浓度为50ug/ml。然后将预扩增产物转入谷氨酸棒杆菌中，在LBHIS恢复培养基中30℃培养，氯霉素浓度为30ug/ml。

培养重组菌，分泌表达alpha-淀粉酶

将转化子转接到装有培养基的三角瓶中进行培养，培养基为BHI培养基，培养条件为30℃，230rpm，培养48小时。

纯化alpha-淀粉酶

将重组菌的培养物离心，获得含有alpha-淀粉酶的上清。然后使用亲和层析技术纯化alpha-淀粉酶溶液，并进行脱盐处理。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201610836135.0 alpha-淀粉酶的制备方法【公开】/alpha-淀粉酶的制备方法【授权】