DNA修复蛋白RAD23抗体的应用及功能分析？ ¹

背景^[1-3]

DNA修复蛋白RAD23抗体是一种多克隆抗体，能够特异性结合DNA修复蛋白RAD23，并主要用于ELISA实验中检测DNA修复蛋白RAD23的水平。

检测原理：采用双抗体夹心法测定标本中DNA修复蛋白RAD23的水平。首先，将纯化的DNA修复蛋白RAD23抗体包被在微孔板上，形成固相抗体。然后，依次加入DNA修复蛋白RAD23和HRP标记的DNA修复蛋白RAD23抗体，使其结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后，加入底物TMB进行显色反应。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，再经酸的作用转化成黄色。颜色的深浅与样品中的DNA修复蛋白RAD23呈正相关。最后，使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中DNA修复蛋白RAD23的浓度。

DNA是生物体内携带遗传信息的重要物质，由于自身结构的特殊性和外界环境的影响，DNA在复制过程中必然会受到各种损伤，因此需要细胞进行修复。研究DNA损伤修复机制可以更准确地理解生物稳定其遗传信息的机理，深入了解基因突变与进化的分子过程。核酸切除修复（NER）途径是生物体内DNA损伤的主要修复方式，其中Rad23基因和Rad4基因是NER途径中具有重要功能的修复因子。已有研究发现，Rad23基因在单细胞的低等生物（酵母）和高等哺乳生物细胞（人类）中对紫外射线等外界因素的响应机制存在差异。

应用^[4][5]

用于家蚕核酸切除修复相关基因的克隆与功能分析

利用RT-PCR和RACE技术成功克隆了家蚕BmRad23基因和BmRad4基因，并对BmRad23基因的功能进行了研究，以下是具体研究结果：

(1) 利用电子与实验克隆相结合的方法，成功克隆了家蚕BmRad23基因。BmRad23 cDNA全长序列由1304 bp碱基组成，5'UTR和3'UTR分别为165bp和164bp，ORF长975bp，编码324个氨基酸。通过生物信息学方法解析氨基酸序列的结构与功能域信息，发现BmRad23氨基酸序列包含有UbL（1-74位氨基酸）、两个UBA（135-172位氨基酸和282-319位氨基酸）功能域以及一个XPC结合位点。

(2) 构建了pET28a/BmRad23表达载体，在大肠杆菌中成功表达了BmRad23蛋白，并通过免疫新西兰兔得到了特异性良好的多克隆抗体。

(3) 通过Northern blot和Western blot技术对BmRad23基因的组织表达特异性和时期表达特异性进行了分析，发现BmRad23基因在家蚕精巢和卵巢中表达量明显偏高。推测BmRad23在5龄后期幼虫精巢和卵巢中表达量的增加是由于生殖细胞减数分裂的原因造成的。

综上所述，BmRad23具有与其他物种Rad23在细胞减数分裂中发挥重要功能相似的特性，在细胞减数分裂等重要发育时期发挥关键作用。此外，由于BmRad23具有UBL/UBA功能域，它在家蚕变态期丝腺中的表达量增高，可能在变态期组织蛋白质降解过程中起到运送目的蛋白和控制蛋白降解的作用。因此，BmRad23在家蚕变态期的组织细胞凋亡和蛋白质降解过程中也具有重要功能，是调节和控制蛋白降解的一个关键因素。

参考文献

[1] Some autophagic and apoptotic features of programmed cell death in the anterior silk glands of the silkworm, Bombyx mori[J]. Ebru Goncu, Osman Parlak. Autophagy. 2008(8)

[2] Rad33, a new factor involved in nucleotide excision repair in Saccharomyces cerevisae[J]. Ben den Dulk, Su Ming Sun, Martina de Ruijter, Jourica A. Brandsma, Jaap Brouwer. DNA Repair. 2006(6)

[3] A concise review of DNA damage checkpoints and repair in mammalian cells[J]. Jaco H. Houtgraaf, Jorie Versmissen, Wim J. van der Giessen. Cardiovascular Revascularization Medicine. 2006(3)

[4] The UBA2 Domain Functions as an Intrinsic Stabilization Signal that Protects Rad23 from Proteasomal Degradation[J]. Stijn Heessen, Maria G. Masucci, Nico P. Dantuma. Molecular Cell. 2005(2)

[5] 徐和平. 家蚕核酸切除修复相关基因的克隆与功能分析[D]. 浙江大学, 2009.