尿道上皮细胞是位于尿道管组织中的细胞，可以通过胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法进行分离，并使用上皮细胞专用培养基进行培养筛选。
尿道是连接膀胱与体外的管道，尿道上皮细胞具有多种功能特殊类型的细胞组成。它们排列在膀胱表面，构成膀胱的防御系统，阻止病原体粘附并保持泌尿器溶解物的不渗透性。此外，尿道上皮细胞还表达多种受体和因子，对损伤和感染起着重要作用，并能释放细胞因子和免疫系统介质。
大鼠尿道上皮细胞的培养方法如下：
1. 取出25cm2培养瓶，用75%酒精消毒，并放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中静置6-8小时或过夜，以稳定细胞状态。
2. 当细胞达到80%汇合时，准备进行传代培养。
3. 细胞传代：
a) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
b) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴3分钟左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
c) 用吸管轻轻吹打混匀，按适当的比例（如1:2或1:3）进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养；
d) 待细胞完全贴壁后，进行培养观察，并每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
通过研究大鼠怀孕期间暴露于邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的模型，检测DBP暴露后代雄性子鼠尿道下裂的发生情况，并研究DBP处理、雄激素受体（AR）信号通路、细胞自噬和上皮-间充质转化（EMT）之间的关联。旨在揭示孕期DBP暴露引起尿道下裂的潜在机制。
方法：
第一部分：通过免疫组化分析、蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR方法，检测DBP暴露引起的尿道下裂组和正常对照组子鼠的尿路上皮组织自噬相关指标（Beclin1和LC3B）以及EMT相关指标的表达变化。
第二部分：通过放射性免疫测定法检测雄性子鼠血清中的睾酮浓度，并通过免疫组化分析、蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR方法比较实验组和对照组子鼠尿路上皮组织中AR蛋白的表达差异。此外，通过质粒转染构建AR过表达的细胞株SV-HUC-AR，并检测DBP处理下外源性表达AR的细胞株和不表达AR的细胞株的自噬相关标志物的表达。
第三部分：使用Western blot和实时荧光定量PCR方法，检测自噬诱导剂氯喹（CQ）或自噬抑制剂雷帕霉素（RAPA）的添加对DBP促进尿路上皮细胞发生EMT效应的影响。同时，检测自噬溶酶体抑制剂和蛋白酶抑制剂的添加对DBP诱导的E-cadherin蛋白降解的影响。
[1] Harris Tony J C, Tepass Ulrich. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 2010.
[2] Y.-H. Wu, Y.-H. Lee, D.T.-Y. Chiu. Knockdown Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase promotes EMT through downregulation of E-cadherin by miR-200b inhibition in A549 cells. The FASEB Journal. 2016.
[3] Oral D, Erkekoglu P, Kocer-Gumusel B, et al. Epithelial-mesenchymal transition: a special focus on phthalates and bisphenol A. Journal of Environmental Pathology and Toxicology. 2016.
[4] S.-W. Wang et al. Androgen receptor-mediated apoptosis in bovine testicular induced pluripotent stem cells in response to phthalate esters. Cell Death Dis. 2013.
[5] 赵圣. 邻苯二甲酸二丁酯通过诱导尿路上皮细胞上皮-间充质转化影响大鼠尿道下裂的机制研究[D]. 上海交通大学, 2018.
1
