大鼠垂体瘤细胞的特点及应用研究？ ¹

大鼠垂体瘤细胞是一种源自大鼠垂体瘤的细胞，主要分泌泌乳素并表达功能性多巴胺受体。这种细胞在免疫抑制的小鼠中无法形成瘤体，但在半固体培养基中可以形成克隆。

GH3细胞是由Tashjian·A·H等人于1965年从一只7月龄的雌性Wistar-Furth大鼠的垂体肿瘤中分离建立的。与GH1细胞不同，GH3细胞是从原代培养的GH1细胞在大鼠体内形成肿瘤后分离建立的。GH3细胞具有上皮细胞样的特征，分泌更高水平的生长激素，并可产生催乳素。研究表明，氢化可的松可以刺激GH3细胞分泌生长激素并抑制催乳素的产生。

细胞培养步骤：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F12K培养基，优质胎牛血清2.5%，HS 15%，双抗1%。

2）培养条件：气相为空气95%和二氧化碳5%，温度为37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。

传代方法：在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存备用。后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

大鼠垂体瘤细胞的应用研究

用于研究RNA干扰对垂体瘤细胞增殖与凋亡的影响

本研究通过设计能够在垂体瘤细胞中稳定高效表达的PTTG-shRNA慢病毒重组载体，研究该重组载体对垂体瘤细胞中PTTG的干扰效果，并进一步明确干扰前后垂体瘤细胞的生长周期与凋亡水平的变化，以探讨PTTG是否可作为未来垂体瘤基因治疗研究的有效靶点。

本实验利用公众网站设计软件，针对目的基因rPTTG靶基因序列，设计了四组shRNA干扰靶点序列（标记为1#、2#、3#、4#），并构建成vshRNA重组载体。将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，经PCR鉴定和测序比对后，成功构建了四组shRNA重组载体。

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，经高纯度无内毒素抽提后，按照说明进行共转染293T细胞，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，经浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，并在293T细胞中测定和标定病毒滴度。

参考文献

[1] Shahenda El-Naggar, Mohammed Malik, Sham Kakar. Small interfering RNA against PTTG: A novel therapy for ovarian cancer. International Journal of Oncology. 2007(1).

[2] D S. Kim, J A. Franklyn, K Boelaert, M C. Eggo, J C. Watkinson, C J. McCabe. Pituitary Tumor Transforming Gene (PTTG) Stimulates Thyroid Cell Proliferation via a Vascular Endothelial Growth Factor/Kinase Insert Domain Receptor/Inhibitor of DNA Binding-3 Autocrine Pathway. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2006(11).

[3] Takeo Minematsu, Masanori Suzuki, Naoko Sanno, Susumu Takekoshi, Akira Teramoto, R. Yoshiyuki Osamura. PTTG overexpression is correlated with angiogenesis in human pituitary adenomas. Endocrine Pathology. 2006(2).

[4] Ricardo Almeida, Robin C. Allshire. RNA silencing and genome regulation. Trends in Cell Biology. 2005(5).

[5] 牟成志. RNA干扰沉默PTTG基因对大鼠垂体瘤细胞增殖与凋亡水平的影响. 山东大学, 2008.