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RT-PCR熔解曲线总是出现双峰,要怎么解决?

做realtime pcr,用的transgen 的SYBR Green 试剂,20ul的反应体系,其中包含

cDNA:0.8ul,      Forward  primer:0.4ul   ,Reverse primer:0.4 ul   ,

Mix: 10ul    ,    ddH2O: 8.4 ul                                                                                                     使用两步法,94度30sec,{ 94度5sec,60度30sec} X45个循环,

退火温度尝试过56度、58度、60度,内参GapDH一直都是单峰,但是目的基因一直有双峰出现,


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共2个回答
是不是引物二聚体,你做个阴性对照(只加引物,不加模板)就知道了。不过看峰的位置,是非特异的扩增,与你的引物或者cDNA有关,你已经试过了多种退火温度都没有改善,说明它影响不大。cDNA反复冻融,容易降解,尤其是浓度比较低的时候;引物可以换另一种引物尝试做
建议你用电泳检测一下定量PCR产物,我怀疑你的产物并不单一,可能有弥散之类的,双峰的结果都不能用,完全没意义    
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