重组抑肽酶(RTI16)是一种非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以抑制激肽酶和胰蛋白酶的活性。它由58个氨基酸残基组成的单链碱性蛋白，具有3个二硫键相互交联。抑肽酶在医学领域有广泛的应用，早期用于治疗急性胰腺炎，后来开始用于心肺胸外科手术，用以保护血小板，减少出血和渗血，并且对凝血障碍病人的治疗也具有临床价值。因此，抑肽酶成为重要的生化药物之一。
图一：重组抑肽酶的结构
目前市售的重组抑肽酶主要是从牛肺等器官提取的，这种方法工艺复杂且成本较高。因此，研究人员开始探讨使用基因工程方法生产重组抑肽酶。采用分泌表达体系时，抑肽酶的产量和活性都较低。通过融合表达的方法，可以显著提高重组抑肽酶的表达量。研究人员构建了重组抑肽酶表达质粒pGrxA-BPTI，并在融合伙伴和重组抑肽酶之间设计了FXa的识别位点。通过凝胶过滤纯化和复性的方法，可以得到与天然产物活性相当的蛋白。通过优化表达条件，重组抑肽酶的产量比以往的表达系统有明显提高。
工程菌表达优化的步骤如下：首先将甘油管菌种接种到LB/Amp平板上培养，然后将菌落接种到LB/Amp液体培养基中，在37℃、200 r/min的条件下过夜培养。接下来，将菌体接入玉米浆培养基中，在37℃、220 r/min的条件下培养，并在诱导7小时后离心收集菌体。最后，通过SDS-PAGE检测表达情况。
另外，还可以使用发酵罐培养的方法来表达重组抑肽酶。在德国Biostat 30 L发酵罐中，控制溶氧和pH值的条件下，可以得到较高的重组抑肽酶产量。
通过以上步骤，可以得到包涵体粗品和包涵体溶解液，进而得到重组抑肽酶。
[1] Ascenzi P, Bocedi A, Bolognesi M, et al. The bovine basic pancreatic trypsin inhibitor (Kunitz inhibitor): a milestone protein[J]. Curr Protein Pept Sci, 2003, 4(3): 231-251.
[2] Sylvie R, Bertil K. Aprotinin[J]. Ann Pharmacother, 1996, 30(4): 372-376.
[3] Conni L, Poul E. BPTI and N-terminal extended analogues generated by factor Xa cleavage and cathepsin C trimming of a fusion protein expressed in E. coli[J]. Protein Expr Purif, 1991, 2(5-6): 372-378.
[4] Bjorn N, Cara B. Secretion incompetence of bovine pancreatic trypsin inhibitor expression in E. coli[J]. J Biol Chem, 1995, 266(5): 2970.
[5] Gu ZY, Marianne Weidenhaupt. Chromatographic methods for the isolation and refolding of proteins from E. coli inclusion bodies[J]. Protein Expr Purif, 2002, 25(1): 174-179.
[6] 姚佳(Yao J), 杨坤(Yang K), 杨建波(Yang JB), 等. 新型重组纤维蛋白原受体拮抗剂的表达、纯化及活性研究[J]. 中国药科大学学报(J China Pharm Univ), 2005, 36(2): 173-178.
1
