氯喹具有关键的作用于疟原虫红内期裂殖体，通过作用48～72小时后，能够消灭血中的裂殖体。虽然氯喹对间日疟的红外线期无效，但对恶性疟有除根的作用。不仅如此，氯喹对红外线期和配子体也没有立即的功效，因此不能用于预防发病原因和终止散播。
氯喹通过破裂疟原虫的核，使体细胞浆出现空泡化，并形成疟黑色素聚集的大块。尽管氯喹不能立即杀死疟原虫，但它可以影响其繁殖。氯喹与核蛋白结合能力强，通过其喹啉环上带负电荷的7-氯基与DNA鸟嘌呤上的2-羟基的靠近，使氯喹插入到DNA的双螺旋结构中。它与DNA产生一氧化氮合酶，从而阻止DNA的复制和RNA的基因表达。
此外，氯喹还可以抑制硫酸铵掺加疟原虫的DNA和RNA，降低核苷酸的生成，从而影响疟原虫的繁殖。通过同位素标记氯喹的实验证明，感染的血细胞可以使氯喹大量积累其中，疟原虫的食物泡和溶酶体是其浓集的位置。氯喹的浓集量与食物泡内的pH值相关，食物泡内的pH值为酸碱性，可导致碱性药物氯喹的浓集。这种浓集消耗了食物泡内的氢氧根离子，进一步提高了食物泡内的pH值，损害了消化吸收血红蛋白浓度的酶，使疟原虫无法消化吸收所摄入的血红蛋白浓度，导致疟原虫缺乏必需的碳水化合物并使脱氧核糖核酸溶解。此外，氯喹还可以影响油酸进入不饱和脂肪酸，控制磷酸脱氢酶和己糖激酶等。
近年来，一些人认为氯喹对疟原虫的初期作用是导致疟黑色素的凝结。疟黑色素的关键成分铁原卟啉Ⅸ（FP）可以危害血细胞，并与氯喹产生一氧化氮合酶来介导氯喹的放疗作用。推测疟原虫体内可能存在一种或多种蛋白激酶，即“FP结合物”，可能是人体白蛋白，可以与FP融合，产生无毒的一氧化氮合酶，使疟原虫细胞外基质免受FP的危害。氯喹的作用机制可能是将“FP结合物”与FP分离，并产生具有毒性副作用的氯喹-FP一氧化氮合酶，从而充分发挥其抗疟作用。蛋白激酶的改变可能导致氯喹失去必要的功效，这可能是疟原虫对氯喹产生耐药性的原因之一。
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