本文介绍了一种使用双抗体夹心法测定标本中猪角化细胞生长因子(KGF)水平的方法。该方法利用纯化的猪角化细胞生长因子(KGF)抗体包被微孔板，制成固相抗体。然后将角化细胞生长因子(KGF)加入包被单抗的微孔中，并与HRP标记的角化细胞生长因子(KGF)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后，加入底物TMB进行显色。根据颜色的深浅和样品中的角化细胞生长因子(KGF)浓度呈正相关关系。最后，使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中猪角化细胞生长因子(KGF)的浓度。
1. 加样：在酶标包被板上设空白孔和待测样品孔。在待测样品孔中先加入样品稀释液40μl，然后再加入待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔。在第一、第二孔中分别加入标准品100μl，并加入标准品稀释液50μl混匀。然后从第一、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加入标准品稀释液50μl混匀。接着在第五、第六孔中分别加入第三、第四孔中的样品50μl，并加入标准品稀释液50μl混匀。然后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔中分别加入标准品稀释液50μl混匀。最后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。
3. 温育：使用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干。每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 温育：操作同步骤3。
7. 洗涤：操作同步骤5。
8. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
9. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
10. 终止：每孔加入终止液50μl，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。
11. 测定：以空白空调零，依次在450nm波长下测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[1] 王伶俐；角质细胞生长因子（KGF）及其受体（KGFR）在口腔扁平苔藓中的表达。《山东大学》 2007年。
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