磷酸钙细胞转染试剂盒的优化及应用？ ¹

背景^[1-3]

磷酸钙细胞转染试剂盒是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，以提高转染效率并降低毒性。该方法适用于多种细胞类型，包括HEK293或HEK293T细胞、Hela细胞和CHO细胞等。磷酸钙细胞转染试剂盒提供的试剂经过无菌处理，方便直接使用。

操作步骤

1. 传代细胞准备：在转染前24小时传代细胞，待细胞密度达到50%～60%时进行转染。

2. DNA沉淀液的准备：将质粒DNA用乙醇沉淀后重悬于无菌水中，加入CaCl2溶液。

3. 逐滴加入DNA-CaCl2溶液：使用巴斯德吸管将DNA-CaCl2溶液逐滴加入HeBS缓冲液中，过程需缓慢进行。

4. 静置30分钟：让细小颗粒沉淀。

5. 加入沉淀：将沉淀逐滴均匀加入培养皿中。

6. 培养细胞：在标准生长条件下培养细胞4～16小时，然后收集或继续培养。

应用^[4][5]

人iPS细胞的诱导及诱导体系的优化研究

本研究对人iPS细胞的诱导体系进行了优化，提供了一个简单、低成本的方案。通过磷酸钙法和QuickShuttle转染试剂对慢病毒载体和逆转录病毒载体进行病毒包装，并研究了不同包装体系、转染时间和明胶包被对病毒制备的影响。

结果表明，使用pLP1、pLP2和pLP/VSVG的3质粒包装体系，并将转染的293T细胞铺在明胶包被的培养皿上，转染72小时可获得较理想的结果。其中，磷酸钙转染法获得的病毒滴度为600TU/mL，QuickShuttle试剂转染法获得的病毒滴度可达7130000TU/mL。

此外，通过组织块培养法获得的原代细胞形态更好，传代后悬浮的死细胞较少。经过丝裂霉素C处理的MEFs成功制备了饲养层细胞，而经病毒感染的hFFCs显示了形态变化。

参考文献

[1] New perspectives on the biology of fragile X syndrome[J]. Tao Wang, Steven M Bray, Stephen T Warren. Current Opinion in Genetics & Development. 2012(3).

[2] Modeling Parkinson's Disease Using Induced Pluripotent Stem Cells[J]. Blake Byers, Hsiao-lu Lee, Renee Reijo Pera. Current Neurology and Neuroscience Reports. 2012(3).

[3] LRRK2 Mutant iPSC-Derived DA Neurons Demonstrate Increased Susceptibility to Oxidative Stress[J]. Ha Nam Nguyen, Blake Byers, Branden Cord, Aleksandr Shcheglovitov, James Byrne, Prachi Gujar, Kehkooi Kee, Birgitt Schüle, Ricardo E. Dolmetsch, William Langston, Theo D. Palmer, Renee Reijo Pera. Cell Stem Cell. 2011(3).

[4] Highly Efficient miRNA-Mediated Reprogramming of Mouse and Human Somatic Cells to Pluripotency[J]. Frederick Anokye-Danso, Chinmay M. Trivedi, Denise Juhr, Mudit Gupta, Zheng Cui, Ying Tian, Yuzhen Zhang, Wenli Yang, Peter J. Gruber, Jonathan A. Epstein, Edward E. Morrisey. Cell Stem Cell. 2011(4).

[5] 程腾. 人iPS细胞的诱导及诱导体系的优化[D]. 内蒙古科技大学, 2014.