大家好,我这边最近做qPCR绝对定量遇到一个现象,就是qPCR的结果和我的菌液镜检结果相差1~2个数量级,下面把结果和实验中的一些参数给大家看看,请帮忙分析一下。
我的qPCR结果显示我菌液浓度约为8E+11copies/ml,显微镜检结果约为3E+9个/ml。
由于不确定细菌基因拷贝数,假如拷贝数为10,qPCR的结果仍然是8E+10 cell/ml,还是比显微镜检高了1个数量级。
虽然显微镜检也是相对定量,结果有与实际值有偏差,但是10倍差在显微镜下差异还是很大的。
我是提取的质粒DNA,用qubit测的浓度为84ng/μl,目的片段碱基数分别为A:T:C:G=59:50:73:95(合计277),质粒用的pMD-19T碱基数A:T:C:G=662::69:676:686(合计2693),计算公式为:标品拷贝数=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660,质粒标品浓度为2.58E+10 copies/μl,质粒进行10倍梯度稀释取2~8次方进行qPCR检测。
标准曲线参数:扩增效率90.6%,R2=0.999,slope=-3.571
溶剂曲线:单峰,无非特异性扩增
样品DNA稀释100倍进行qPCR检测,下机拷贝数为:1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液离心洗涤,400μl重悬破壁后取上清200μl提DNA,50μl去离子水洗脱,
DNA拷贝数计算公式为:菌液DNA含量(copies/ml)=(1.56E+7)x100x50x2/0.2,结果约为8E+11copies/ml
小木虫今天没法上传图片,只能辛苦大家看文字版了,谢谢!