本人第一次做分子实验,从设计shRNA,构建shRNA敲除载体开始,现在已经构建好,开始验证是否构建正确,遇到如下问题,想请教路过的各位大神,谢谢。
问题1: 将构建好的质粒转化大肠杆菌,从同一个板上挑了三个转化子摇菌,分别提取质粒,经跑胶验证质粒是否提出来,大小是否一致,结果发现三个质粒不是同一个大小,有人遇到过这种情况吗?是什么原因呢?是我构的质粒有问题还是这种本身就会出现假阳性克隆?
问题2:为了验证酶切空载质粒回收这一步是否正确,有人建议将酶切回收后的这段序列进行转化铺板,如果板上不长菌就说明酶切空载这步是正确的,但是结果是长了,我当时觉得我的质粒加多了,正常的别人质粒浓度1000ng/ul,只加1ul,我当时加了4ul,会不会部分没有切成功,导致回收的片段中还有完整质粒存在,这样做能说明质粒没切成功吗?大家一般会这样做来验证吗?
问题3:如果排除前面的问题,我最后构建的符合我要的发大小的质粒,做了双酶切验证,发现都是符合我的要求的,唯一就是问题2中出现的问题,如果没长就确定我构建成功,但是现在长了,是否证明我没有构建成功?