臭氧是一种强氧化剂，能够通过生化氧化反应来进行灭菌。臭氧杀菌有三种形式：
1、臭氧可以氧化分解细菌内部降解葡萄糖所需的酶，从而阻止TCA循环的进行，导致细菌无法产生细胞生命活动所需的ATP，进而使细菌失活。
2、臭氧直接与细菌和病毒相互作用，破坏其细胞器、DNA和RNA，干扰细菌的新陈代谢，导致细菌死亡。
3、臭氧通过细胞膜组织，进入细胞内部，作用于外膜的脂蛋白和内层的脂多糖，导致细菌发生通透性畸变并溶解死亡。
臭氧对细菌的灭活反应非常迅速。与其他杀菌剂不同的是，臭氧能够与细菌细胞壁的脂类双键发生反应，渗入细菌内部，作用于蛋白质和脂多糖，改变细胞的通透性，从而导致细菌死亡。此外，臭氧还能够作用于细胞内的核物质，如核酸中的嘌呤和嘧啶，破坏DNA。
臭氧对病毒的作用首先是破坏病毒衣壳蛋白的4条多肽链，破坏RNA，尤其是构成它的蛋白质。经过臭氧氧化后，电镜观察发现病毒表皮破碎成许多碎片，大量核糖核酸从中释放出来，干扰了病毒对宿主细胞的吸附。臭氧杀菌的彻底性是毋庸置疑的。
臭氧的杀菌或抑菌作用通常是物理、化学和生物方面的综合结果。其作用机制可以概括为：
(1)作用于细胞膜，导致细胞膜通透性增加，细胞内物质外流，细胞失去活性；
(2)使细胞活动所必需的酶失活；
(3)破坏或使细胞内的遗传物质失效。臭氧通过直接破坏核糖核酸或脱氧核酸来杀死病毒。臭氧要杀死细菌和霉菌微生物，首先作用于细胞膜，使细胞膜的成分受到破坏，引起代谢紊乱，抑制其生长。臭氧继续渗透并破坏膜中的脂蛋白和脂多糖，改变细胞通透性，导致细胞溶解和死亡。
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