细胞色素P450酶能够催化多种反应，包括饱和碳氢键羟基化反应、双键环氧化反应、杂原子氧化反应、脱烷基化反应和芳香烃氧化反应等。在使用分子氧作为氧化剂的反应中，P450酶将分子氧中的一个氧原子插入到底物中，第二个氧原子则利用由还原酶蛋白中NAD (P) H提供的两个电子得到还原生成水分子。由于只有分子氧O2中的一个氧原子与底物结合，因此细胞色素P450酶属于单加氧酶。
细胞色素P450酶催化烃类C-H键的羟基化反应循环，以CYP101(P450cam)为例，其中铁卟啉配合物核心结构按照简化的方式进行描述。底物与低自旋三价铁中心干扰了水分子与血红素铁的配位，并使自旋态向与底物结合后的高自旋配合物转变。高自旋Fe3+具有很高的还原电位，因此在CYP101中易于还原为亚铁态，结合氧生成的oxy-P450配合物是该循环中相对稳定的中间体。oxy-P450配合物还原后依次形成过氧正铁中间体及质子化后的氢过氧正铁中间体，远端氧原子处第二次质子化后依次进行0-O键异裂和形成"化合物I"及水，然后底物发生氧合作用得到产物配合物，最终产物ROH被释放。这个循环被许多实验方法所证实，由于在动力学研究中，中间体十分活泼而且难以发生明显积累，因此该反应循环很难直接测定。
在此循环中有多个中间体，至少有3个分支点，可导致在生理条件下使反应发生中断。三个使催化循环发生中断的主要副反应如虚线箭头所示，分别为：①oxy-P450配合物的自氧化反应，同时生成过氧离子和酶返回到稳定态；②过氧化物支路，配位的过氧化物和氢过氧化物阴离子从铁原子上解离，得到过氧化氢；③氧化酶解偶联，而铁-氧中间体被氧化成水，而不是与底物发生氧合反应，导致分子氧四电子还原生成两分子水。
细胞色素P450酶催化机理的研究对其他单加氧酶反应机理的研究有指导意义，例如甲烷单加氧酶的反应机理，在初期结构表征信息尚不充分的情况下，主要是根据细胞色素P450酶的研究结果推测出来的。
有关细胞色素P450酶催化机理的讨论主要集中在血红素中铁和氧的状态变化：①氧结合到还原的血红素铁形成氧合血红素铁；②该配合物单电子还原得到过氧态铁，并易于质子化形成氢过氧化物；③Fe3+-OOH-配合物的末端氧原子的第二次质子化，形成不稳定的过渡态Fe-OOH2，然后发生异裂释放出H2O分子；④在各种反应中保持高价态的卟啉铁氧配合物，即所谓的"化合物I"。
在上述反应第②~④步中的中间体是下列活性酶所共同具有的：细胞色素P450、过氧化酶、细胞色素氧化酶、血红素加氧酶等。从催化氧活化反应机理角度看，目前涉及"活性氧中间体"的血红素酶有：血红素加氧酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、氧化氮合成酶、过氧合酶等。这些具有不同功能的活性酶中拥有相似的高活性血红素氧配合物，它们通过蛋白质来有效控制不同的反应功能，通过对比不同种类酶中的类似活性中间体，有助于区分每种酶的主要特征，有利于发现血红素基酶催化中蛋白质的活性功能。过氧化物酶、加氧酶和过氧化氢酶在各自的反应循环中，都具有类似的高价态金属离子中间体。
针对P450酶催化环烃、芳香烃侧链羟基化反应，也有学者提出了自由基机理。
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