肝细胞培养基的配方及应用？ ¹

肝细胞培养基是一种专门设计用于正常人类肝细胞体外培养的培养基。它包含了必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5%)。该培养基的缓冲体系为重碳酸盐，在含有5%CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。通过选择性地促进正常人类微血管内皮细胞的增殖和生长，该培养基能够使细胞达到最理想的营养平衡状态。

肝细胞培养基的配方包括500 ml基础培养基，25ml胎牛血清，5ml肝细胞生长添加物和5 ml青霉素/链霉素溶液。

肝脏是由肝细胞组成的，肝细胞非常小，肉眼无法看到，必须借助显微镜才能观察到。人体肝脏约有25亿个肝细胞，每5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人体肝脏的肝小叶总数约为50万个。肝细胞呈多角形，直径约为20-30微米，有6-8个面，不同的生理条件下大小会有所差异，如在饥饿时，肝细胞的体积会增大。每个肝细胞的表面可以分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞内含有许多复杂的细微结构，如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体和液泡等。

肝细胞培养基的应用

如何研究TGF-β1对肝细胞再生分化和凋亡的调控机制？

转化生长因子β1被认为是一种多功能细胞因子，参与调节细胞的增殖、分化以及组织的增生和免疫等重要生理作用。最近的研究发现，TGF-β1还能抑制多种人类肿瘤的生长。对于对TGF-β1敏感性丧失的肝硬化和肝癌来说，阐明肝细胞生长和凋亡调控的分子和细胞学机制，可能为肝脏疾病的防治提供新的思路。

研究方法采用50% CCL4腹腔注射的方法，在8周的时间内诱导BALB/c小鼠形成肝硬化模型。利用改良的胶原酶原位灌注法分离正常和肝硬化小鼠的肝细胞。通过使用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带，来观察TGF-β1诱导的凋亡。为了检测TGF-β1（5ng/ml）和caspase诱导的凋亡，使用DNA荧光染料Hoechst 33342对肝细胞核进行染色，并在荧光显微镜下观察比较caspase-3和caspase-8在TGF-β1诱导的凋亡中的作用。

选择了三种具有不同p53基因状态的人肝癌细胞系，使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）对TGF-β1诱导的肝癌细胞凋亡进行定量检测。为了明确凋亡机制，还对上述细胞系进行了荧光素酶定量检测。首先，使用LF2000将含有Smad结合元件和荧光素酶、t3基因的TGF-β1可诱导的荧光素酶报告质粒转染到细胞中，然后经过TGF-β1的作用，分别检测其相对荧光素酶活性。

在应用TUNEL检测的三个细胞系中，TGF-β1只能诱导HepGZ细胞（野生型p53）的凋亡，而Hub7（突变型p53）和Hep3B细胞（缺失型p53）的凋亡较少。荧光素酶检测结果表明，HepGZ细胞对TGF-β1的反应较强，而Hub7和Hep3B细胞的荧光素酶表达较低。这表明凋亡与Smad和p53的表达之间存在明确的联系。

参考文献

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[5]王春雷.TGF-β1对肝细胞再生分化及凋亡的调控作用机制[D].中国人民解放军军医进修学院,2003.