细胞微管分离试剂盒的应用及相关研究？ ¹

背景^[1-3]

细胞微管分离试剂盒是一种用于逐步分离、富集和提取细胞组分中蛋白质的工具。它可以应用于细胞质、细胞膜、细胞核、染色质结合蛋白以及细胞支架蛋白等的分离。所得的组分与蛋白质检测和下游应用兼容。

使用细胞微管分离试剂盒时，首先使用细胞质抽提缓冲液(CEB)与细胞孵育，然后使用细胞膜抽提取缓冲液(MEB)和细胞核抽提取缓冲液(NEB)依次提取细胞区室。接下来，在含有染色质结合蛋白的NEB提取物中加入微球菌核酸酶(MNase)，最后加入沉淀提取缓冲液(PEB)以溶解细胞骨架蛋白。

细胞微管示意图

微管蛋白是球形分子，包括两种类型：α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)。这两种亚基有相似的氨基酸序列，表明它们可能由同一原始祖先演变而来。

此外，这两种微管蛋白与细菌中的一种叫作FtsZ的GTPase(分子量为40kDa)同源，这种酶具有类似微管蛋白的功能，能够聚合并参与细胞分裂。α和β微管蛋白的亚基都是直径为4nm的球形分子，它们组成的异源二聚体的长度为8nm。

α和β微管蛋白各自具有一个GTP结合位点，位于α亚基上的GTP结合位点是不可逆的，结合上去的GTP不能被水解，也不能被GDP替换。位于β亚基上的GTP结合位点结合GTP后能够被水解成GDP，因此这个位点也被称为可交换的位点(exchangeable site，E位点)。

除了微管蛋白，还有一种叫作γ微管蛋白的蛋白质，它虽然不是微管的组成成分，但参与了微管的组装。最近的研究显示，几种原核蛋白与微管蛋白也存在关联。

应用^[4][5]

吴茱萸碱对SPC-A1细胞微管蛋白表达的影响及机制研究

本研究旨在通过研究吴茱萸碱对SPC-A1细胞微管蛋白表达的影响，探究其抗肿瘤作用机制。

采用免疫荧光化学染色法和激光共聚焦显微镜观察吴茱萸碱对SPC-A1细胞中α-tubulin的影响及其形态学变化。利用MTT法检测吴茱萸碱和MG132对细胞增殖的影响，以及二者共同作用对细胞增殖的影响。通过Western blot法检测吴茱萸碱对α-，β-，γ-tubulin表达的变化，以及吴茱萸碱与MG132共同作用后的表达变化。

流式细胞术检测吴茱萸碱对SPC-A1细胞周期的影响，以及MG132对吴茱萸碱诱导的细胞周期变化的影响。实验结果显示，吴茱萸碱作用于SPC-A1细胞后，可破坏α-tubulin结构，且破坏程度与药物浓度和作用时间呈时间和剂量依赖性。

吴茱萸碱能够抑制SPC-A1细胞的增殖，但与MG132共同作用后，其抑制作用明显减弱，对细胞的杀伤作用显著减小。吴茱萸碱对α-tubulin的表达具有时间和剂量依赖性，但对β-，γ-tubulin的表达没有影响。

参考文献

[1]A novel microtubule-modulating agent induces mitochondrially driven caspase-dependent apoptosis via mitotic checkpoint activation in human prostate cancer cells[J].Ritu Aneja,Tohru Miyagi,Prasanthi Karna,Tucker Ezell,Deep Shukla,Meenakshi Vij Gupta,Clayton Yates,Sreenivasa R.Chinni,Haiyen Zhau,Leland W.K.Chung,Harish C.Joshi.European Journal of Cancer.2010(9)

[2]Straight GDP-Tubulin Protofilaments Form in the Presence of Taxol[J].Céline Elie-Caille,Fedor Severin,Jonne Helenius,Jonathon Howard,Daniel J.Muller,A.A.Hyman.Current Biology.2007(20)

[3]A plus-end raft to control microtubule dynamics and function[J].Niels Galjart,Franck Perez.Current Opinion in Cell Biology.2003(1)

[4]Protective effects of calcitonin gene-related peptide-mediated evodiamine on guinea-pig cardiac anaphylaxis[J].Wei-Qing Rang,Yan-Hua Du,Chang-Ping Hu,Feng Ye,Gui-Shan Tan,Han-Wu Deng,Yuan-Jian Li.Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology.2003(3)

[5]田秀丽.吴茱萸碱对SPC-A1细胞微管蛋白表达的影响及机制研究[D].吉林大学,2013.