如何使用沉淀法MIRNA分离试剂盒分离纯化小RNA? ¹

沉淀法MIRNA分离试剂盒是一种用于从总RNA中分离纯化小RNA的方法，无需使用离心吸附柱。通过该方法可以得到长度大部分在200 nt以下的小RNA，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA和snRNA等。分离得到的MIRNA可以用于后续实验，如RT-PCR、miRNA标记和microarray等。

沉淀法MIRNA分离试剂盒是一种方便快捷的方法，以下是使用步骤：

1. 在纯化好的100μl总RNA(含大RNA和小RNA)中，加入50μl溶液A，振荡30秒混匀。如果RNA样品体积不足100μl，可以用RNase-free水补足，如果体积超过100μl，可以用本公司核酸浓缩剂浓缩到100μl。

2. 室温12000～15000g离心30分钟。小RNA在上清中，大RNA在沉淀中。

3. 小心将上清液转移到干净的1.5mL RNase-free塑料离心管中。留下的沉淀可以用75%乙醇洗涤后做大RNA电泳对照用。

4. 在上清液中加入200μl溶液B，振荡30秒混匀。

5. 室温12000～15000g离心10分钟，小心弃上清。由于溶液B中有惰性的助沉剂，所以得到的小RNA沉淀肉眼可见。

6. 加入1mL溶液C，震荡数秒。

7. 室温12000～15000g离心10分钟，小心弃上清。

8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体(约50μL左右)。

9. 在沉淀中(含小RNA)加入30-100μl RNase-free水，吹打溶解即得小RNA溶液。

10. 最好先PAGE-银染检测小RNA纯度再使用。

沉淀法MIRNA分离试剂盒的应用是什么？

血浆外泌体miR-92a-3p在系统性红斑狼疮中的作用及其机制研究

该研究旨在探究血浆外泌体及其内部异常miRNA对系统性红斑狼疮(SLE)的影响及其潜在机制。

研究发现，来自SLE患者血浆的外泌体一方面能够促进PBMC细胞凋亡并上调炎症细胞因子表达；另一方面还能够被肾小管上皮细胞HK2摄取，促进HK2细胞凋亡。通过高通量测序和RT-PCR验证，研究发现miR-92a-3p在SLE患者血浆外泌体中显著下调，并与疾病活动程度和狼疮性肾炎有关。

此外，miR-92a-3p水平还与患者24小时尿蛋白、补体C3和C4水平显著相关，但与患者性别、年龄、病程、是否服用免疫抑制剂和自身抗体水平无关。这表明miR-92a-3p有望成为SLE诊断、判断疾病活动以及狼疮性肾炎评估的潜在标志物。

为了进一步探究血浆外泌体miR-92a-3p影响SLE的机制，研究利用miRNA数据库对miR-92a-3p的靶基因进行预测，并用双荧光素酶报告系统和Western Blot方法进行验证。

结果表明，miR-92a-3p能够通过与LATS2基因3’UTR不完全互补抑制LATS2基因表达，并抑制下游YAP/TAZ磷酸化。肾组织免疫组织化学染色结果显示，LATS2在肾小管上皮细胞中高表达，在肾小球中低表达或不表达，且SLE患者肾小管和肾小球中LATS2水平略高于正常肾组织。

此外，miR-92a-3p还可促进PBMC和HK2细胞凋亡和炎症细胞因子表达。综上所述，研究发现SLE患者血浆外泌体能够通过调节PBMC和肾组织细胞凋亡及炎症反应影响疾病活动。而这一作用的实现可能与外泌体中miR-92a-3p及其靶基因LATS2有关。

参考文献

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[5] 王丽.血浆外泌体miR-92a-3p在系统性红斑狼疮中的作用及其机制研究[D].南方医科大学,2019.