如何培养和传代大鼠气道平滑肌细胞? ¹

大鼠气道平滑肌细胞是气管的重要组成部分，对机体的正常生理过程起着重要作用。在气道平滑肌细胞原代分离培养3天后，细胞会贴壁伸展，形态大小不一，核呈卵圆形。2周后，细胞会汇合并呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起。传代后的细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。气道平滑肌细胞的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生和肥大是气道重塑的关键。

气道平滑肌细胞的特性

形态特性：类似成纤维细胞

生长特性：贴壁生长

培养条件：使用DMEM（高糖）+10% FBS

传代方法：1:3传代，每2-3天进行一次

冻存条件：使用无血清细胞冻存液

污染检测：支原体、细菌、酵母和真菌检测结果为阴性

如何培养和传代气道平滑肌细胞？

细胞复苏：

1. 将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2. 如果细胞密度达到80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加入2mL消化液（0.25% Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按照6-8mL/瓶的比例补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按照1:2到1:5的比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：

当细胞生长状态良好时，可以进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1mL含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10% DMSO后进行冻存。

主要参考文献

[1] 王宇, 孙婧, 金融, 梁宜, 刘艳艳, 尹磊淼等. 针刺对哮喘大鼠气道重建模型气道平滑肌细胞T型钙通道蛋白表达的影响. Chinese Acupuncture & Moxibustion.