背景：[1-3]
人原位胰腺腺癌细胞是从一位61岁女性患者的胰腺癌组织中提取的上皮样细胞。BxPC-3原位胰腺腺癌细胞不表达囊肿性纤维化跨膜电导调节子(CFTR)，而CFTR阳性的细胞株是Capan-1。
细胞复苏操作：
1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。
2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过zui易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。
5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。
6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
研究miR-29c在胰腺癌侵袭转移中的作用方法:1.RT-PCR检测5株不同分化能力胰腺癌细胞株（PANC-1,Bx Pc-3,Hs766t,cFPAN,Capan1）的miR-29s的表达,Western Blot及明胶酶谱法检测5株不同分化能力胰腺癌细胞MMP2的表达和活性,利用Spearman等级相关统计方法分析在胰腺癌细胞中miR-29s表达与MMP2表达的相关性。
2. 通过转染miRNA mimic和miRNA inhibitor分别构建mi R-29c的过表达和干扰表达;CCK-8检测mi R-29c表达对胰腺癌细胞增殖能力影响;Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验分别检测mi R-29c表达对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
3.结合生物信息学预测和荧光素酶活性报告基因证实mi R-29c调控MMP2表达的分子机制。
结果:1.在胰腺癌细胞中,mi R-29c表达与MMP2蛋白表达呈负相关。
2.过表达miR-29c对胰腺癌细胞的增殖能力无影响,但可明显抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力;干扰mi R-29c表达后可显著增强胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
结论:1.在细胞水平和活体水平证实mi R-29c通过靶向调控MMP2表达抑制胰腺癌侵袭转移。
2.mi R-29c调控MMP2是调控胰腺癌转移的一个重要机制,但存在其它机制调控胰腺癌侵袭转移;在胰腺癌肝转移过程中,miR-29c是调控MMP2的一个重要因素,但并不是唯一的。
[1]Moving targets:Emerging roles for MMPs in cancer progression and metastasis[J].Gemma Shay,Conor C.Lynch,Barbara Fingleton.Matrix Biology.2015
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[3]MicroRNAs in Pancreatic Cancer:Involvement in Carcinogenesis and Potential Use for Diagnosis and Prognosis[J].Tereza Halkova,Romana Cuperkova,Marek Minarik,Lucie Benesova,Leticia Moreira.Gastroenterology Research and Practice.2015
[4]Systematic analysis of metastasis-associated genes identifies miR-17-5p as a metastatic suppressor of basal-like breast cancer[J].Meiyun Fan,Aarti Sethuraman,Martin Brown,Wenlin Sun,Lawrence M.Pfeffer.Breast Cancer Research and Treatment.2014(3)
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