最近在做重叠pcr，片段A（409bp）、B（1777bp），目的片段为2100多bp。我的做法是，第一轮用引物对E\F扩增出A、R\T扩增出B、胶回收，引物F和R有26bp重叠，重叠部分Tm59℃。第二轮用片段A和B为模版，不加引物扩增5循环，然后用加引物E和T扩增25循环。（10ul体系：酶5ul；片段A 15ng；片段B 45ng；引物E\T 各0.5ul；水补到10ul）（反应条件：94℃ 2min；98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 40s；72℃ 2min）5和25循环条件都是如此，用的是塔克拉的快速高保真酶。但是总是没有目标条带，而在600bp位置出现非特异条带，而且条带非常的亮。退火温度也换过53℃，55℃，60℃，结果都是一样。大伙觉得我这是哪里出了问题，有没有好的解决办法呢？
