我打算用sacB负筛选的方法敲除aeromonas hydrophila基因，基本流程是这样的：将基因上下游500bp序列连接起来后连到pre112敲除质粒上（转大肠杆菌WM3064)，然后结合转移到aeromonas hydrophila中，在
氯霉素平板上得到第一次重组克隆，挑单克隆接种到无
氯化钠LB小管中（含氯霉素），用上游正向引物和下游反向引物扩增可以得到两条带（一条正常大小，一条敲除大小片段），然后挑阳性克隆接种到无氯化钠LB小管中（不含氯霉素），长出后稀释涂10%蔗糖平板，得到第二次重组克隆，用基因外围扩增一直得不到敲除菌。
目前：有几个现象。1.大肠杆菌WM3064阳性克隆（含pre112和敲除片段）在DAP+LB+氯霉素平板可以生长，但在蔗糖+DAP+LB+氯霉素平板不生长，证明sacB基因应该没有失活。
2.第一次重组克隆在LB+氯霉素平板可以生长，但在蔗糖+LB+氯霉素平板也生长，挑了100多个都是这样，理论上阳性克隆（含sacB）应该对蔗糖敏感。
3.第二次重组克隆在LB+蔗糖平板可以生长，但在LB+氯霉素平板也生长，挑了200多个都是这样，理论上阳性克隆经过第二次重组丢掉氯霉素和sacB应该对氯霉素敏感。
我现在不清楚到底是我这个菌对蔗糖不敏感还是sacB基因失效了。请教大家有没有什么好办法解决这个问题。
