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如何制备感受态细胞并应用于基因工程研究? 1

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大肠杆菌在经过特定处理后可以摄取外源DNA,这种状态下的细胞被称为感受态细胞。M15[pREP4]菌株携带有阻抑质粒pREP4,该质粒能够高水平表达lac抑制子,在IPTG诱导前抑制蛋白表达。通过卡那霉素抗性筛选可以保持pREP4质粒在菌株中的稳定性。

制备感受态细胞的操作方法

1. 将保存在-80℃的农杆菌感受态在冰上或室温融化。

2. 每100μl感受态细胞中加入1ug质粒DNA,混匀后依次在冰上静置10分钟、液氮中5分钟、37℃中5分钟、冰浴中5分钟。

3. 加入700μl无抗生素的2YT或LB液体培养基,于28℃振荡培养2~3小时。

4. 以5000rpm离心一分钟收菌,留取约100μl上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的2YT或LB平板上,倒置放于28℃培养箱中培养2-3天。

感受态细胞在基因工程研究中的应用

一项研究公开了一种利用大肠杆菌M15感受态细胞表达香蕉多酚氧化酶基因的方法。该方法通过提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录,得到香蕉PPO的编码区序列,构建含有PPO的重组质粒pQE?80L-PPO,将该质粒加入到M15感受态细胞中,最终得到香蕉PPO表达菌。该方法具有技术简单、成本低、操作快速、蛋白表达量高等特点,并且制备的重组蛋白易于纯化和具有生物学活性。

另外一项研究涉及一种制备鸡干扰素γ的复性方法。该方法包括对鸡干扰素γ基因进行PCR扩增,将扩增产物亚克隆到带有6His标记的pET32a表达载体上,将该载体转化到M15细胞内,诱导与表达产物后进行裂解获得表达产物,最后纯化并进行复性处理得到成品。该方法使用pET32a和M15细胞使得鸡干扰素γ基因高效表达的产物纯化后的纯度高于传统方法,并且复性后蛋白得率也更高,制成的总蛋白中有效成分增加,提高了治疗效果,降低了成本。

主要参考资料

[1] M15感受态细胞说明书

[2] CN201410620945.3一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法

[3] CN201110208387.6一种鸡干扰素γ的制备复性方法

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