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本文将讲述Kurthia gibsonii SC0312羰基还原酶如何催化（R）-1-苯基-1,2-乙二醇不对称合成，旨在为相关领域的研究人员提供参考依据。
背景：手性醇化合物在手性药物、食品香料、化学农药和液晶材料等领域发挥着重要的作用。生物法催化手性醇合成具有高对映体选择性、反应条件温和、反应溶剂绿色、可持续性等优点，受到了广泛的关注。(R)-1-苯基-1,2-乙二醇常用作合成手性精细化学品中间体。
合成：
彭飞等人从土壤中筛选得到一株催化2-羟基苯乙酮（HAP）高对映体选择性还原合成(R)-1-苯基-1,2-乙二醇{(R)-PED}的 Kurthia gibosonii SC0312菌株。
1. 方法一：
（1）通过基因工程技术将SpyTag和SpyCatcher分别与FDH和Kg BDH融合得到两个融合酶FDH-ST和Kg BDH-SC，它们可以借助自组装元件SpyTag和SpyCatcher的 自催化特性连接得到一个分子量更大的酶蛋白。
（2）Kg BDH-SC和FDH-ST在pH 6.0-7.0时都表现出较好的活性，在pH 7.5和 35 ℃的条件下它们催化HAP还原和甲酸铵氧化的比活力分别为3.6 U/mg和9.1 U/mg。
（3）融合酶Kg BDH-SC和FDH-ST通过蛋白自组装和交联法固定在氨基化二氧化硅纳米粒子上得到共固定化酶Kg BDH-SC-ST-FDH-SiO2，其最佳制备条件为：活化载体浓度10 mg/mL，总蛋白浓度0.6 mg/mL，Kg BDH-SC与FDH-ST的摩尔比为1:1，自组装时间和交联时间均为2 h。在此条件下制备的共固定化酶的酶固定化量为44.3 mg/g，酶回收率为49%，且其活性是传统随机共固定化酶Kg BDH-SC-FDH-SiO2的2.9倍。
（4）Kg BDH-SC-ST-FDH-SiO2在pH 7.0-7.5和35 ℃的酶活较好，对映体选择性受pH和温度的影响较小，在所考察的pH范围和温度范围催化合成的(R)-PED的光学纯度达到99%以上。
（5）与游离混合酶相比，Kg BDH-SC-ST-FDH-SiO2在pH和有机试剂稳定性方面具有明显优势。KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2的温度稳定性比传统随机共固定化酶KgBDH-SC FDH-SiO2的稍好。共固定化酶KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2在重复使用8批次后酶活仍保留52.5%。
（6）在水相反应体系中，Kg BDH-SC-ST-FDH-SiO2在pH 7.5和25 ℃条件下可催 化60 mmol/L HAP不对称还原得到(R)-PED的产率和光学纯度分别为83.9%和> 99%。
2. 方法二：
（1）通过交联法将FDH-ST固定在氨基化二氧化硅纳米粒子上，固定化FDH-ST 无法与游离KgBDH-SC发生自催化反应制备有序共固定化酶Kg BDH-SC-ST-FDH@SiO2。
（2）通过交联法将KgBDH-SC固定化在氨基化二氧化硅纳米粒子上，再通过自组装元件的自催化反应固定化FDH-ST，可制备有序共固定化酶FDH-ST-SC-Kg BDH@SiO2。当共固定化酶的制备条件为：活化载体浓度10 mg/mL，Kg BDH-SC浓度0.6 mg/mL，交联固定化4 h，FDH-ST浓度0.4 mg/mL，组装1 h时，有序共固定化酶FDH-ST-SC KgBDH@SiO2的Kg BDH-SC和FDH-ST的固定化量分别为35.7 mg/g和21 mg/g，有序共固定化酶的活性回收率为50%。
（3）FDH-ST-SC-KgBDH@SiO2在pH 6.5-7.5的活性较好，在温度20-40 ℃活性随温度的升高而增加，考察的pH和温度对有序共固定化酶催化合成的产物的对映体过量 率无显著影响，均达到99%以上。
（4）FDH-ST-SC-Kg BDH@SiO2比游离混合酶具有更好的pH稳定性和有机试剂稳 定性；有序共固定化酶在pH 5.5-8.0和含有机试剂的缓冲液中表现出良好的稳定性。另外，有序共固定化酶在重复使用8批次后活性仍保留51.7%。
（5）在含非水介质的磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.5）反应体系中，FDH-ST-SC KgBDH@SiO2在pH 7.5和25℃条件下可催化80 mmol/L HAP不对称还原合成(R)-PED，产率为87.4%，对映体过量率达到99%以上。
参考文献：
[1]彭飞. Kurthia gibsonii SC0312羰基还原酶的挖掘及其催化（R）-1-苯基-1,2-乙二醇不对称合成的研究[D]. 华南理工大学, 2020. DOI:10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004821
[2]徐小琳,穆晓清,徐岩. (R)-1-苯基-1,2-乙二醇脱氢酶的纯化及酶学性质 [J]. 无锡轻工大学学报(食品与生物技术), 2004, (06): 33-37.
