如何制备WST-8试剂盒中的主要成分? ¹

2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐，简称WST-8，是细胞活性检测剂CCK-8试剂盒中的一种主要成分。CCK-8试剂盒是一种用于检测细胞增殖和细胞毒性的试剂盒，具有方便使用、高灵敏度、良好的重复性和无放射性的特点。然而，WST-8的市售价格较高，使得该试剂盒变得昂贵。

制备方法

1）化合物3的制备

首先，在一个500ml的三口瓶中取得化合物2(4.94g，0.0322mol)，加入150ml的甲醇，并加热搅拌至回流溶解。待冷却至50℃后，缓慢加入化合物1(10.0g，0.0322mol)。保持恒温50℃，继续搅拌2小时。然后进行减压抽滤，并用少量的甲醇洗涤，得到化合物3(11.065g，0.0249mol)，收率为77.4%。

¹H-NMR(400MHz，D₂O)δH：6.83(d，2H，J=9Hz)，7.65(dd，1H，J=8Hz，1Hz)，7.81(d，2H，J=9Hz)，7.93(d，1H，J=8Hz)，8.03(d，1H，J=1Hz)，8.31(s，1H)。

2）4-硝基-2-甲氧基重氮盐的制备

首先，在一个50ml的单口瓶中取得2-甲氧基-4-硝基苯胺(3.7g，0.0220mol)，并将其置于-10~0℃的冰浴中。然后加入15ml的盐酸溶液，该盐酸溶液是由6.67ml的浓盐酸和水稀释得到的。搅拌5分钟后，缓慢滴加由1.64g的亚硝酸钠溶解于10ml水得到的溶液。加完后，继续搅拌30分钟，即可得到重氮盐溶液。

3）化合物4的制备

首先，在一个500ml的三口瓶中取得化合物3(10.0g，0.0224mol)，加入200ml的甲醇，并搅拌5分钟。然后边加入15ml的NaOH水溶液，边加入之前制备的重氮盐溶液。加完后，在-10~5℃的冰浴中搅拌2小时，然后在室温下继续搅拌2小时。此时，反应体系呈墨绿色。接下来，用4ml浓盐酸稀释的盐酸溶液8ml调至深红色。蒸干溶剂后，加入200ml石油醚进行超声处理，然后进行减压抽滤，得到化合物4(12.054g，0.0193mol)，为红棕色固体，收率为86.2%。

¹H-NMR(400MHz，D₂O)δH：3.65(s，3H)，7.42(t，4H)，7.50(d，1H，J=2Hz)，7.69(d，1H，J=9Hz)，8.03(m，3H)，8.33(d，1H，J=1Hz)。

4）2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑单钠盐的制备

首先，在一个500ml的单口瓶中取得化合物4(12.054g，0.0193mol)，加入120ml的甲醇，使其呈深红棕色。搅拌5分钟后，加入NBS(5.0g，0.0281mol)的丙酮溶液100ml。搅拌约1小时，颜色会变浅，继续搅拌直至反应体系呈黄色。然后进行减压抽滤，得到黄绿色固体。最后进行重结晶（乙醇/水=2），并进行真空干燥，得到化合物2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑单钠盐(6.211g，0.0099mol)，为浅黄色固体粉末，收率为51.6%。

¹H-NMR(400MHz，D₂O)δH：3.54(s，3H)，7.95(m，6H)，8.13(d，1H，J=8Hz)，8.34(m，3H)；1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δH：3.74(s，3H)，7.86(m，2H)，8.06(d，1H，J=2Hz)，8.14(d，2H，J=9Hz)，8.24(dd，1H，J=8Hz，2Hz)，8.30(d，1H，J=1Hz)，8.54(d，3H，J=9Hz)。

主要参考资料

[1]CN201210358733.3 2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐的合成方法