如何构建shRNA文库以实现RNA干扰技术? ¹

shRNA文库的构建是RNAi文库制备过程中的一个关键步骤。RNA干扰是一种在真核生物中常见的基因表达调控机制，通过将长链dsRNA加工处理成21-24nt的siRNA，siRNA进入RISC复合体实现对靶基因的特异性降解。shRNA技术作为RNA干扰的重要工具，已经成为哺乳动物功能基因研究的重要途径。基于shRNA的RNAi文库技术可以提高RNAi的效果，为大规模、高通量的基因功能研究提供支持。

构建shRNA文库的方法如下：首先，利用内切酶MmeI在距离识别位点20bp处切割双链DNA，形成含有20bp的短发卡结构DNA。然后，将目的DNA片段消化并与人工合成的具有小发卡结构的寡核苷酸片段连接，经过MmeI酶切和回收形成单链发卡DNA。接下来，将单链发卡DNA与人工合成的寡核苷酸片段连接，并通过引物延伸和链置换使单链发卡DNA转变为具有反向重复结构的双链DNA。最后，将双链DNA克隆到表达载体上。利用这种方法，可以构建含有数百万个克隆的shRNA文库。

主要参考资料

[1] RNA干扰(RNAi)文库研究进展