急求！！有人知道测序结果总在某几个碱基突变是为啥吗？

急求！！有人知道测序结果总在某几个碱基突变是为啥吗，我是用同源重组方法连接的，含有突变位点的基因是分别设计基因的上游和下游引物以及突变位点片段的引物做的，也测序过一次正确的，但后来老是在相同位点发生突变。测序过这个含突变位点的基因已经快十次了