用的是pET22b(+)，大小是5493bp，目的片段是936bp。采用的是内切酶BamH I和Nde I，大概操作如下：
PCR获得目的片段后，利用质体提取试剂盒提取质粒，然后分别双酶切，并设置酶切对照，电泳验证酶切完全，之后是胶回收，利用T4 DNA ligase连接，质粒与目的片段大概是1:4~1:8比例加入，然后16℃连接过夜，第二天做感受态，采用的是CaCl2法转化，并设置阴性对照（感受态直接转化涂布抗性平板）和阳性对照（空质粒转化抗性平板），平板过夜培养后，阴性对照无菌落，阳性对照长满整个平板，说明感受态制备较好，抗性平板也具备筛选能力，实验组菌落分布也比较均匀，长的有七八十个单菌落，但是提取质粒验证均与空质粒大小一致，见图。
起初以为是双酶切效果不好，也做了两步单酶切。但是也没有连上。将原来已经构建好的质粒（我要做的是对其中一个氨基酸进行突变，所以有野生型构建好的质粒）经酶切后，再胶回收连接，转化提取结果仍是空质粒。大家给分析一下 是什么原因？ 
