小鼠B细胞杂交瘤细胞的制备及应用？ ¹

小鼠B细胞杂交瘤细胞是一种通过融合骨髓瘤细胞和B淋巴细胞制备的细胞，主要用于制备单克隆抗体。杂交瘤细胞的制备通常通过瘤细胞培养来完成。

杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞并保持其主要特征。其中一种细胞是经抗原免疫的小鼠细胞，另一种是小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞具有抗体分泌功能和在选择培养基中生长的特征，而小鼠骨髓瘤细胞具有无限分裂和增殖的能力。只有融合了B细胞和骨髓瘤细胞的杂交细胞才能在选择培养基中持续增殖，并同时具备抗体分泌功能和细胞永生性。这种细胞被称为杂交瘤细胞。

制备杂交瘤细胞的方法是将脾B细胞和骨髓瘤细胞加入聚乙二醇（PEG）中促进细胞融合，然后在HAT培养基中继续培养融合细胞。

细胞融合物中包含以下类型的细胞：

• 脾-脾融合细胞：无法生长，脾细胞无法在体外培养。
• 骨-骨融合细胞：无法利用次黄嘌呤，但可以通过第二途径利用叶酸还原酶合成嘌呤。氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此无法生长。
• 骨-脾融合细胞：能够在HAT培养基中生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，而骨细胞提供细胞分裂功能。

杂交瘤细胞的应用

用于鼠抗人GL50单克隆抗体的制备及其生物学功能的研究

本研究旨在制备鼠抗人GL50分子的单克隆抗体，并对其进行相关生物学特性的鉴定。同时，利用自主研制的GL50mAb，研究ICOS/GL50信号途径在机体体液免疫应答和肿瘤免疫中的生物学作用。

实验方法包括：

1. 使用天然高表达人GL50分子的B淋巴瘤Daudi细胞作为免疫原免疫Balb/C小鼠。
2. 利用B淋巴细胞杂交瘤技术将免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。
3. 通过间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞株进行筛选，以筛选出能够识别人GL50-L929和VK-L929转基因细胞的单抗。
4. 通过竞争抑制实验检测单抗识别抗原位点的情况。
5. 采用常规方法制备染色体，分析杂交瘤细胞核型。
6. 通过免疫亲和层析纯化腹水型单抗。
7. 使用快速试纸鉴定单抗类型。
8. 利用间接免疫荧光标记法测定单克隆抗体的效价，并检测单抗在不同细胞株和细胞上的表达。
9. 通过Western-blotting实验检测单抗与Daudi细胞和GL50-L929转基因细胞GL50膜蛋白的结合能力。
10. 利用免疫组织化学检测单抗对不同组织中GL50分子的识别能力。
11. 利用~3H-TdR法，结合GL50-L929转基因细胞，研究ICOS/GL50信号途径在活化T细胞体外增殖中的作用。
12. 采用ELISA法检测GL50-L929和自行制备的GL50mAb对活化T细胞分泌细胞因子IL-2和IL-10的影响，并检测ICOS-L929和GL50mAb对PWM介导的B细胞分泌抗体的生物学效应。

参考文献

[1] McAdam AJ, Greenwald RJ, Levin MA, et al. ICOS is critical for CD40-mediated antibody class switching. Nature. 2001.

[2] Dong C, Juedes AE, Temarm UA, et al. ICOS co-stimulatory receptor is essential for T-cell activation and function. Nature. 2001.

[3] Bonhagen K, Liesenfeld O, Stadecker MJ, et al. ICOS+Th cells produce distinct cytokines in different mucosal immune responses. European Journal of Immunology. 2003.

[4] Hutloff A, Dittrich AM, Beier KC, et al. ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature. 1999.

[5] 朱伟. 鼠抗人GL50单克隆抗体的制备及其生物学功能的初步研究[D]. 苏州大学, 2004.